新疆多浪羊IFN-γ基因地高辛探针的标记与敏感性检测

艾东旭,徐宏伟，李 玮,张 晶,宋显明,李莲瑞

(1. 塔里木大学 生命科学学院，新疆阿拉尔 843300; 2. 新疆兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300; 3.塔里木大学 动物科学学院，新疆阿拉尔 843300)



新疆多浪羊IFN-γ基因地高辛探针的标记与敏感性检测

艾东旭1,徐宏伟1，李 玮1,张 晶1,宋显明1,李莲瑞2,3

(1. 塔里木大学 生命科学学院，新疆阿拉尔 843300; 2. 新疆兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300; 3.塔里木大学 动物科学学院，新疆阿拉尔 843300)

为获得多浪羊IFN-γ地高辛探针，并对其标记效率进行检测。将多浪羊pMD-18T-IFN-γ克隆菌进行PCR扩增，经切胶回收及目的基因浓缩后获得目的基因IFN-γ，然后用地高辛标记和检测试剂盒对IFN-γ基因进行标记，获得IFN-γ地高辛探针。IFN-γ的PCR扩增产物经8 g/L琼脂糖电泳分离后转移至Hybond N+膜，膜上显影后进行敏感性检测并计算探针质量浓度，结果显示，IFN-γ地高辛探针在杂交液中的质量浓度为30 μg/L。Southern杂交显示，Hybond N+膜上有IFN-γ基因的双链DNA，且浓缩后的DNA(2.5 μg)标记的特异性探针质量浓度较高，可以在Hybond N+膜上呈现出清晰的杂交条带，证明获得的探针质量浓度符合要求。

多浪羊；IFN-γ基因；地高辛；探针标记；检测

多浪羊主要分布在新疆喀什的麦盖提、岳普湖、巴楚、莎车等县，因其中心产区在麦盖提县，故又称麦盖提羊。其具有个体大、耐干旱、耐低营养水平以及抗逆、抗病、适应性强等优良性状，且肉质鲜嫩多汁、肉色泽纯正，营养价值高，是一个优良肉脂兼用型绵羊品种[1]。

干扰素(inerferon，IFN)是发现最早，也是第一个被克隆化并用于临床疾病治疗的细胞因子，因其基因和蛋白的结构、功能特性不同，被分为3类：Ⅰ型干扰素包括IFN-α(包括多个亚型)、IFN-β等；Ⅱ型干扰素为干扰素-γ(IFN-γ)；Ⅲ型是基因结构含有内含子的IFN-λ。IFN-γ是水溶性二聚体细胞因子，是Ⅱ型干扰素的唯一成员，主要由活化的T细胞和NK细胞分泌产生[2]，在免疫反应的后期发挥重要的免疫调节作用[3]，是多浪羊体内一种重要的免疫调节细胞因子，对病毒等有害物质的感染有抵抗作用，具有抗肿瘤[4]、抗病毒、抗寄生虫等生物学功能。

由于细菌、病毒等有害物质的侵袭，导致动物机体免疫功能受到抑制[5]。IFN-γ在疾病诊断、治疗和疫苗免疫效果[6]检测等方面有重要作用，因此，本研究采用地高辛试剂盒标记IFN-γ基因探针，对IFN-γ基因地高辛探针进行标记并对其敏感性进行检测，以期为后续研究新疆多浪羊分子免疫奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

多浪羊pMD-18T-IFN-γ[7]克隆菌由新疆兵团塔里木畜牧科技重点实验室保存；T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；地高辛试剂盒、Hybond N+膜均购自罗氏公司；DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；其他试剂均由国产分析纯配制。

1.2 方 法

1.2.1IFN-γ基因的制备与扩增 制备：取100 μL pMD-18-T-IFN-γ[7]克隆菌接种至LB broth液体培养基(Amp+)，气浴，37 ℃、180 r/min 培养8 h。扩增：将各组份溶液加至PCR管，反应体系见表1。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，50.5 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s， 30个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存，备用。

表1 PCR反应体系

1.2.2IFN-γ基因切胶回收 将PCR产物经8 g/L 琼脂糖凝胶电泳分离后，紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶于1.5 mL离心管。计算凝胶质量(提前记录1.5 mL离心管质量)，将该质量作为1个凝胶体积(按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒说明书，100 mg记为100 μL)。再按照切胶回收试剂盒的操作步骤进行目的DNA的洗脱。

1.2.3IFN-γ目的基因浓缩 在PCR回收产物中加入3 μL 3.0 mol/L乙酸钠充分混匀，再加入总体积(3.0 mol/L乙酸钠和PCR回收产物体积之和)2.5倍的无水乙醇，充分混匀，-20 ℃沉淀过夜。

4 ℃、12 000 r/min离心30 min，弃上清留沉淀；取600μL 经-20 ℃预冷的φ=70% 乙醇洗涤沉淀，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，弃上清留沉淀；重复洗涤3次后置于无菌操作台干燥10 min，加入16 μL PCR H2O溶解沉淀，充分溶解后取1 μL测定核酸质量浓度。

1.2.4IFN-γDNA质量浓度测定 按下“7/dsDNA”键，将50 μL 1×TE加至比色皿，按下“blank”键调零，作为空白对照；用蒸馏水多次冲洗比色皿；加入1 μL浓缩后的IFN-γ基因和39 μL 1×TE缓冲液，充分混匀，按下“sample”键，记录读数。

1.2.5 地高辛标记IFN-γ探针 取10 μL经核酸蛋白仪测定的IFN-γ(0.25 g/L)，加入5 μL PCR H2O，混匀，沸水浴变性10 min，迅速冰浴冷却5 min；冰浴中加入2 μL六聚核苷酸混合物、2 μL dNTP混合物、1 μL Klenow酶，混匀，离心数秒，37 ℃孵育20 h，65 ℃保持10 min终止反应。

根据地高辛试剂盒说明书计算孵育20 h后地高辛标记的DNA产量，根据表2可以计算模板DNA产量，原则上模板DNA量为10～3 000 ng 均可以被标记。

表2 适宜条件下地高辛标记DNA的产量

在标准反应中均以1 000 ng DNA为模板。1 h内，大约有15%的核苷酸参与到0.8 μg新合成的地高辛标记DNA；20 h后约消耗38%的核苷酸。

使用DIG-High-Prime溶液，增加不同模板DNA的量进行反应，并检测反应1 h和反应20 h时的差异。地高辛标记DNA的产量由放射线示踪器进行测定，并通过斑点杂交进行证实 (10个独立标记实验的平均值)。

1.2.6IFN-γ标记DNA质量浓度的确定 地高辛标记DNA质量浓度直接影响试验结果，通常情况下，标记的探针和地高辛标记的对照DNA质量浓度均应为1 mg/L。标记的探针和地高辛标记的对照DNA按照表3进行一系列的梯度稀释。

1.2.7IFN-γ探针的southern杂交 紫外灯下观察电泳结果，记录 DNA Marker位置，然后将无用部分及凝胶左上角切掉，作为指示凝胶方位标记。蒸馏水淋洗凝胶，置于0.2 mol/L HCl溶液中摇动漂洗5 min。蒸馏水淋洗凝胶，浸于变性液(0.4 mol/L NaOH，0.6 mol/L NaCl)中室温摇动变性30 min。蒸馏水淋洗凝胶，浸于中和液[0.5 mol/L Tris-Cl(pH 7.4)，1.5 mol/L NaCl]中室温摇动中和30 min。将一玻璃板置于盛有10×SSC缓冲液(含3.0 mol/L NaCl和0.3 mol/L柠檬酸钠，pH 7.0)的浅盘，上铺一张Whatman 3 mm滤纸，滤纸边缘浸于缓冲液，赶净气泡；凝胶背面朝上放于滤纸上，用保鲜膜做一个窗口，封住凝胶的四周，防止吸印短路；另取一张Whatman 3 mm滤纸，将其与尼龙膜用蒸馏水浸润后置于10×SSC缓冲液，5 min后取出轻放于凝胶上；尼龙膜上再铺一张Whatman 3 mm滤纸，并将吸水纸置于滤纸上，上方再压一玻璃板及500 g左右物体，转膜8 h，期间更换吸水纸14～16次。转好的膜干燥30 min，于交联仪中120 mJ保持30 s。

表3 探针的梯度稀释

1.2.8 预杂交与杂交 预杂交：用ddH2O将Hybond N+尼龙膜预湿，再用5×SSC缓冲液预湿。将Hybond N+尼龙膜(转膜面向液面)置于杂交管，加入68 ℃预热的预杂交液10 mL，置于杂交炉中68 ℃预杂交至少2 h，回收预杂交液。

杂交：取地高辛(DIG)标记的IFN-γ探针20 mL，沸水浴5 min，迅速冰浴冷却，离心数秒后加至经68 ℃预热的标准杂交液(于50 mL离心管)，充分混匀后置于杂交炉，68 ℃杂交16 h。

洗膜：取Hybond N+尼龙膜，先用50 mL 2×SSC缓冲液、0.1 g/L SDS高盐洗液(室温)洗涤15 min，倾去洗液后再重复洗1次；然后用50 mL 0.1×SSC缓冲液、0.1 g/L SDS低盐洗液在杂交炉中68 ℃洗涤15 min，倾去洗液后再重复洗1次。

1.2.9 免疫检测 封闭：将Hybond N+尼龙膜从杂交管中取出，置于直径150 mm平皿，用100 mL马来酸洗液(含φ=3%吐温-20)于室温下洗膜5 min，将膜放入10 g/mL封闭液，置于水平摇床匀速晃动60 min(0.5 h换面1次)。

显色：取100 g/L封闭液(含φ=0.1% Anti-DIG-AP复合物5 μL)50 mL，室温孵育60 min(0.5 h换面1次)；再用100 mL马来酸缓冲液室温下洗膜2次，每次15 min；随后将Hybond N+尼龙膜放入检测缓冲液(AP Buffer)平衡5 min，然后置入新配制的显色液中，室温避光显色16～24 h；取出Hybond N+尼龙膜用ddH2O冲洗2遍终止反应，观察结果。

2 结果与分析

2.1IFN-γ基因的PCR扩增、切胶回收及浓缩对比

IFN-γPCR产物经8 g/L琼脂糖凝胶电泳分离后，在574 bp处可见目的条带(图1)。

图1 IFN-γ基因PCR产物

将目的条带切胶回收，经8 g/L琼脂糖凝胶电泳分离后与DNA Marker DL2000比较，发现目的条带大小(574 bp)与预期相吻合(图2)；IFN-γ目的基因经浓缩后，经8 g/L琼脂糖凝胶电泳后与DNA Marker DL2000比较，发现目的条带大小(574 bp)与预期相吻合(图3)，并且浓缩后的目的条带比切胶回收的条带清晰，DNA质量浓度较高，便于后续的探针标记。

图2 IFN-γ基因切胶回收结果

图3 IFN-γ基因浓缩

2.2 核酸质量浓度测定

经核酸蛋白仪测定，1 μL浓缩的IFN-γ基因与39 μL 1×TE缓冲液混匀后产物的质量浓度为0.006 25 g/L，推测原IFN-γ的质量浓度为0.25 g/L。

2.3IFN-γ地高辛探针标记效率检测结果分析

探针标记效率检测旨在确定最适探针质量浓度及检测探针的敏感性；探针质量浓度过高(或过低)，会导致标记效率过高(或过低)，不利于控制杂交时标记探针的加入量。将地高辛Southern杂交试剂盒提供的地高辛标记的对照DNA进行稀释，使其质量浓度分别为10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0 μg/L。采用稀释地高辛标记的对照DNA的方法稀释标记探针，并将标记的探针与对照组进行对应点比对(图4)，结果显示，地高辛标记的对照DNA 5号条带与IFN-γ地高辛探针的4号条带相似，说明两者信号强度接近，推测IFN-γ地高辛探针的质量浓度约为0.3 μg/L。将IFN-γ地高辛探针质量浓度乘以相应的稀释倍数，计算得出IFN-γ地高辛探针质量浓度为15 mg/L。当杂交液体积为10 mL时，需加入20 μLIFN-γ地高辛标记探针。即IFN-γ地高辛探针在10 mL杂交液中的质量浓度为30 μg/L，可以达到试验所需质量浓度。

图4 IFN-γ地高辛探针标记效率检测

2.4 Southern杂交

将地高辛标记的IFN-γ基因与Hybond N+膜上的DNA进行特异性杂交。经洗膜、封闭显色后，在Hybond N+膜上出现清晰的杂交条带(图5)，说明，地高辛标记的IFN-γ基因与Hybond N+膜上的DNA特异性结合，杂交成功。适宜探针质量浓度较难掌握，若探针质量浓度过高或者封闭时间过短，在Hybond N+膜上容易产生背影，而质量浓度过低则容易导致信号减弱，因此，可根据显影后的杂交效果对探针质量浓度进行微调，若背影值较高，可将杂交液进行适当稀释，信号比较低时，可再加入少量探针。杂交过程中，应尽量控制杂交液体积，使其刚覆没尼龙膜，因为杂交液体积过多会造成不必要的浪费，而过少则会影响杂交效果。

图5 IFN-γ地高辛探针Southern杂交

3 讨 论

3.1 地高辛技术

地高辛标记探针原位杂交技术是以地高辛配基为标记物，通过非放射性检测系统(如酶促或荧光等)，检测组织、细胞及染色体上特异性DNA或RNA序列的一种技术[8]，是一种直接、简便的研究基因定位与表达的方法[9]。地高辛标记探针技术可用于鉴别特异基因的表达部位、分析基因转录的含量变化、确定有无病毒感染以及染色体图谱分析等，在筛选重组克隆、基因多态性检测等方面应用广泛[10]。孙小慧等[11]认为，地高辛标记DNA探针杂交方法适用于人狂犬病疫苗Vero细胞DNA残留量的测定。

3.2 地高辛技术的优点

地高辛标记探针，克服同位素探针受半衰期限制、曝光时间长、背景结构欠清晰、污物处理困难等缺点，也避免内源性生物素对研究结果的干扰，具有操作方便、检测时间短[11]、结构清晰、不受抗原抗体干扰的限制、探针灵敏度高[12]、结果便于肉眼分辨、无半衰期、杂交液可重复使用3～5次、保存1 a仍有活性、不会对环境和人造成危害等优点，是目前常用的分子生物学诊断技术[13]。

3.3 地高辛技术的应用

本研究结合杜卫东等[8]、孙小慧等[11]、黄相红等[13]的研究结果，成功构建细胞因子IFN-γ地高辛探针，并对其标记效率进行检测，为多浪羊免疫学研究另辟新径。本研究发现，通过标记效率检测时，杂交时间必须严格控制在16 h内；显色时间在14 h可出现杂交斑点；转膜必须充分，从而保证DNA已转至膜上；杂交混合物中探针质量浓度过高或封闭时间不足容易产生背景，而质量浓度过低则易使信号变弱；洗膜时，如果洗膜不充分会导致背景太深，洗膜过度又可能导致假阴性。

4 结 论

IFN-γ地高辛探针标记表明，探针质量浓度对研究结果影响明显。本研究标记的IFN-γ地高辛探针在10 mL杂交液中的质量浓度为30 μg/L，可达到试验所需质量浓度。

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(责任编辑：郭柏寿 Responsible editor:GUO Baishou)

Digoxin Probe Labeling and Sensitivity Detection ofIFN-γGene in Xinjiang Duolang Sheep

AI Dongxu1,XU Hongwei1,LI Wei1,ZHANG Jing1,SONG Xianming1and LI Lianrui2,3

(1.College of Life Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China; 2.Key Laboratory of Tarim Husbandry Science and Technology,Xinjiang Production & Construction Group,Alar Xinjiang 843300,China;3.College of Animal Science,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China)

In order to obtain Duolang sheepIFN-γdigoxin probe,and detecting its labeling efficiency,the pMD-18T-IFN-γ colonies of Duolang sheep was amplified by PCR. After cutting and recovering the gel and concentrating of target gene,the final desiredIFN-γwas obtained,and then theIFN-γgene was labeled by digoxin and detection kit and theIFN-γdigoxin probe was obtained. TheIFN-γPCR product was isolated by 8 g/L agarose gel electrophoresis,and then transferred to Hybond N+membrane,after the membrane developing perform,sensitivity was detected and the probe mass concentration was calculated. The results showed that the mass concentration probe was 30 μg/L in the hybridization solution. The southern hybridization indicated that there is the double-stranded DNAIFN-γgene of Hybond N+membrane,and higher concentration of labeled specific probe was detected from mass concentrated DNA (2.5 μg),there was a clear hybridizing band in Hybond N+membrane,which proved that the probe mass concentration was up to standard mass concentrations.

Duolang sheep;IFN-γgene; Digoxin; Labeled DNA probe; Detection

AI Dongxu,male,master student. Research area: the pathogen and immunology of animal. E-mail: xuxude0718@163.com

LI Lianrui,female,doctoral student,master supervisor. Research area: the pathogen and immunology of animal. E-mail: lilianrui51@163.com

2016-01-22

2016-03-30

国家自然科学基金(30960277)；新疆生产建设兵团应用基础研究(2007JC07)；塔里木大学校长基金(TDZKCX201401)。

艾东旭，男，在读硕士，研究方向为畜禽病原及免疫学。E-mail:xuxude0718@163.com

李莲瑞，女，博士研究生，硕士生导师，研究方向为畜禽病原及免疫学。E-mail:lilianrui51@163.com

日期：2016-10-20

S826

A

1004-1389(2016)10-1436-06

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20161020.1653.002.html

Received 2016-01-22 Returned 2016-03-30

Foundation item The National Natural Science Foundation of China (No.30960277);the Applied Basic Research Projects of Xinjiang Production and Construction Corps (No.2007JC07);the Headmaster Fund of Tarim University.