氢氧化钠预处理对甘蔗渣酶解和发酵性能的影响

张宪宝， 张 腾， 谢文化， 朱明军*

(1. 华南理工大学 生物科学与工程学院， 广东 广州 510006； 2. 广州甘蔗糖业研究所， 广东 广州 510316)



·研究报告——生物质材料·

氢氧化钠预处理对甘蔗渣酶解和发酵性能的影响

张宪宝1， 张 腾1， 谢文化2， 朱明军1*

(1. 华南理工大学 生物科学与工程学院， 广东 广州 510006； 2. 广州甘蔗糖业研究所， 广东 广州 510316)

采用氢氧化钠预处理甘蔗渣，通过单因素和正交试验考察了不同预处理条件对甘蔗渣酶解和发酵性能的影响，并进一步分析了比表面积和木质素含量对酶解性能的影响。结果表明：预处理温度、氢氧化钠质量分数及预处理时间对酶解和发酵效率影响较为显著，最佳的预处理条件为：温度85 ℃、时间11 h、NaOH质量分数4.5 %，在此优化条件下预处理的甘蔗渣，含纤维素56.46 %，与原料相比提高了46.16 %；半纤维素20.30 %、 Klason木质素5.79 %，与原料相比分别降低了15.77 %和72.87 %，酶解36 h的还原糖得率为0.69 g/g(以甘蔗渣质量计)。经过氢氧化钠预处理后的甘蔗渣比表面积显著增加(由原料的0.07 m2/g最大可增加到1.07 m2/g)，木质素显著降低，有利于提高酶解和发酵效率。当比表面积超过0.30 m2/g时，酶解初始速率和酶解效率达到平衡；当木质素低于11 %时，酶解效率达到平衡。

氢氧化钠预处理；甘蔗渣；酶解发酵

随着煤、石油和天然气等化石燃料的日益枯竭，人们不得不加紧寻找可替代能源以满足日益增长的能源需求[1-2]。地球上有着大量的生物质资源，全球每年由光合作用产生的木质纤维原料达4 500亿吨[3]，可以利用这些生物质资源进行生物转化生产燃料乙醇。利用玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、甘蔗渣等生物质资源生产燃料乙醇，不仅可以实现工农业废弃物资源的再利用，而且极大地避免了因直接燃烧带来的环境污染问题，具有广阔的发展前景。由于木质纤维原料的组成及结构特点，阻碍了纤维素酶与底物的接触，降低了酶解效果，木质纤维原料需要经过预处理才能提高其酶解性能。因此，若要提高底物的利用率、糖化效率及可发酵性糖的产量，必须打破原有的结晶结构，降低木质素含量，增大底物的孔隙率，增加酶与底物的结合位点，从而提高糖化速率及利用率[4]。碱处理可以在低温条件下进行，不仅纤维素和半纤维素损失少，而且无抑制产物形成，受到了广泛的研究[5-8]。在碱性环境下，半纤维素及木质素分子间的酯键发生皂化，酯键的断裂引起木质素溶解，同时纤维素、半纤维素和木质素间的孔隙增大，造成纤维素溶胀和结晶度降低等[9]。由于氢氧化钠可以有效地去除木质素，使纤维素润胀[10]，因而被广泛用于制浆造纸工艺[11]。本研究采用氢氧化钠为预处理试剂，分析不同预处理条件对甘蔗渣组成、酶解和发酵性能的影响，并且对比表面积和木质素含量与酶解效率之间的关系进行了探究。

1 实 验

1.1 实验材料

1.1.1 甘蔗渣 甘蔗渣原料(未经预处理)由广州甘蔗糖业研究所提供，取粒径小于0.38 mm的部分，粉碎，取粉径小于0.15 mm的粉末，烘干至绝干待用，主要成分如下：纤维素38.63 %、半纤维素24.10 %、 Klason木质素21.34 %、酸溶木质素3.09 %。

1.1.2 酶 纤维素酶 Celluclast 1.5L(诺维信，丹麦)：纤维素酶酶活为23.87 FPU/mL，β-葡萄糖苷酶酶活为21.89 U/mL。

1.1.3 菌种 融合酵母 SHY 07-1(Saccharomycescerevisiae与Pichiastipitis的融合子)，由华南理工大学生物科学与工程学院发酵工程研究室保藏。

1.1.4 培养基 培养基按照参考文献[12]进行配制。

1.2 实验方法

1.2.1 氢氧化钠预处理的单因素试验 称取甘蔗渣原料各10.00 g于500 mL的三角瓶中，加入质量分数分别为0.1 %～5 %的NaOH溶液，分别在不同液固比(10∶1～30∶1，mL∶g)和不同温度(30～80 ℃)下反应不同时间(1～12 h),处理结束后，先3 000 r/min 离心10 min弃去处理液，再用蒸馏水水洗，直至pH值近中性。对样品进行抽滤，然后置于60 ℃烘箱中烘干，并用密封袋在室温下保存。用于测定成分含量及糖化发酵。

1.2.2 氢氧化钠预处理的正交试验设计 考虑到预处理条件对酶解及发酵效率的影响，本研究对处理温度、时间及NaOH质量分数3个因素进行优化，以获得最佳的预处理条件。以液固比为20∶1，使用正交助手Ⅱ(v3.1)软件设计3因素3水平的正交试验。

1.2.3 预处理后甘蔗渣的酶解 酶解反应在15 mL的西林瓶中进行，酶解体系为10 mL，底物质量分数为4 %。称取原料甘蔗渣和处理过的样品0.4 g，加入9.4 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH值4.8)和0.2 mL 25 g/L的MgCl2溶液(MgCl2终质量浓度为0.5 g/L)，加胶塞及铝盖，121 ℃灭菌20 min，待冷却后，在超净台中按20 FPU/g(以甘蔗渣质量计，下同)加入无菌过滤的纤维素酶液，于40 ℃、 200 r/min下反应72 h。分别在0、 1、 2、 4、 6、 8、 12、 24、 36、 48和72 h取样0.2 mL，样品立即放于沸水中煮沸3 min终止酶解反应，然后于12 000 r/min离心5 min，取上清液0.15 mL稀释10倍后测定还原糖。酶解效率的计算公式如下：

Y=C1/[C2×(W1×1.11+W2×1.14)]×100%

式中：Y—酶解效率，%；C1—酶解液中还原糖的质量浓度，g/L；C2—酶解初始甘蔗渣质量浓度，g/L；W1—甘蔗渣中葡聚糖质量分数，%；W2—甘蔗渣中木聚糖质量分数，%； 1.11—葡聚糖和葡萄糖之间的转换系数； 1.14—木聚糖和木糖之间的转换系数。

1.2.4 同步糖化共发酵(SSCF) 发酵在25 mL西林瓶中进行，工作体积为15 mL。称取氢氧化钠处理过的甘蔗渣0.6 g (4 %底物质量分数)，加入13.25 mL的自来水、 0.3 mL的25 g/L MgCl2(终质量浓度为0.5 g/L)溶液和45 μL的0.1 g/L玉米浆溶液(终质量浓度为0.3 g/L)，并调节初始pH值至4.8～5.1，加胶塞及铝盖，121 ℃灭菌20 min，冷却后，在无菌条件下按20 FPU/g加入无菌过滤的纤维素酶液，0.9 mL的酵母菌种子液(200 mg/L 湿菌体，6 %的接种量)，于30 ℃、 200 r/min下发酵120 h。在发酵过程中，每隔24 h 取样0.2 mL，并立即12 000 r/min离心8 min，取0.1 mL上清液稀释至1 mL并加入50 μL的10 %硫酸酸化，经0.22 μm膜过滤后于-20 ℃冰箱保存。发酵液中乙醇通过HPLC测定，发酵效率计算公式如下：

y=C3/[C4×(W1×1.11×0.51+W2×1.14×0.46)]×100%

式中：y—发酵效率，%；C3—发酵液中乙醇的质量浓度，g/L；C4—发酵初始甘蔗渣质量浓度，g/L； 0.51—葡萄糖和乙醇之间发酵转换系数； 0.46—木糖与乙醇之间的发酵转换系数。

在深静脉血栓发生率和知识掌握度方面,观察组均要明显优于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),如表1。

1.3 分析方法

1.3.1 比表面积测定 采用Brunauer-Emmett-Teller (BET)法(氮吸附法)测定预处理后甘蔗渣的比表面积[13]。

1.3.2 甘蔗渣成分分析 甘蔗渣中葡聚糖、木聚糖和酸溶木质素的测定参考国际生物能源中心提供的方法《Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass》(2007-6-1)[14]，Klason木质素的测定参考国标GB/T 747—2003[15]。

1.3.3 酶活测定 纤维素酶酶活以FPU/mL表示，定义为：在50 ℃条件下60 min内分解滤纸产生1 μmol葡萄糖为1个活力单位。酶活测定依照美国可再生能源实验室出版的方法《Measurement of Cellulase Activities》。β-葡萄糖苷酶酶活单位(U/mL)定义为：在测定条件(pH值 5.0， 50 ± 2 ℃)下，每分钟水解底物产生1 μmol对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活单位。酶活测定方法参考韦斌如建立的pNPG比色法[16]。

1.3.4 还原糖浓度测定 测定采用DNS法(3,5-二硝基水杨酸法)。

1.3.5 乙醇浓度测定 发酵液中乙醇通过HPLC(Waters 2695)测定。检测条件：柱子 Bio-Rad Amnex HPX-87H；进样量 10 μL；流动相 5 mmol/L H2SO4，流速 0.6 mL/min；柱温 60 ℃；检测器 Waters 2414型示差折光检测器，检测器温度 40 ℃，运行时间 15 min。

2 结果与讨论

2.1 不同条件对预处理效果的影响

表 1 NaOH质量分数对预处理甘蔗渣成分的影响

对所处理的样品进行酶解及同步糖化共发酵(SSCF)，图1(a)及1(b)分别显示了酶解效率和发酵效率随NaOH质量分数变化的关系。由图可以看出，随着NaOH质量分数的增加，酶解效率和发酵效率不断提高，且两者的变化趋势相同，即质量分数1 %以下处理的样品效果较差，可能是由于NaOH的添加量低的原因。 Cullis等[17]指出，在用NaOH处理木质纤维原料时，NaOH的添加量要高于10 %(以原料质量计)。而质量分数高于1 %处理的样品，不同时间的酶解效率和发酵效率与未处理原料相比平均提高了3～7倍。当质量分数由0.1 %增加到5 %时，酶解效率(72 h)和发酵效率(120 h)分别从10.08 %和12.85 %增加至65.49 %和57.83 %。NaOH质量分数越高，木质素的去除率也越高，同时，样品的比表面积也越大，从而提高了样品的酶解和发酵效率[13,17]。

图 1 氢氧化钠质量分数对预处理后甘蔗渣酶解(a)及发酵(b)性能影响

2.1.2 预处理温度 如表2所示，预处理温度对葡聚糖和木质素的含量有较大的影响，而对木聚糖影响不明显。当温度超过60 ℃时，木质素下降较快，当温度为80 ℃时，Klason木质素由原料的21.34 %降为6.29 %，70.52 %的Klason木质素被去除。从酶解(图2(a))及发酵(图2(b))效果来看，温度对其有着显著的影响。特别是对于甘蔗渣的发酵效率来说，随着预处理温度的升高，发酵效率显著上升。

表 2 温度对预处理甘蔗渣成分的影响

图 2 温度对预处理后甘蔗渣酶解(a)及发酵(b)性能影响

2.1.3 预处理时间 从表3可知，随着处理时间的延长，葡聚糖含量逐渐增大，9 h达到最大，为52.76 %；而木聚糖和木质素的含量则是逐渐降低，木聚糖的降低可能是由于浸泡时间延长，引起木聚糖的溶解。其中，预处理12 h后，木质素降至10.22 %，相比原料降低了52.10 %。

从图3(a)及3(b)可以看出，处理时间对酶解及发酵均有显著影响，酶解及发酵效率都随着处理时间的延长而增大。而该结果与文献[18-19]报道的不同，可能是由于本研究中NaOH的添加量较低的原因。随时间延长，处理时间对效率的影响逐渐变小，当处理时间由9 h延长至12 h时，发酵效率仅从55.29 %提高到57.62 %，说明当处理时间达到9 h后，发酵效率可能达到了一个临界值。

表 3 时间对预处理甘蔗渣成分的影响

图 3 时间对预处理后甘蔗渣酶解(a)及发酵(b)性能影响

2.1.4 液固比 表4和图4分别给出了液固比对预处理甘蔗渣成分和酶解及发酵效率的影响。如表4所示，随着液固比的增大，葡聚糖含量逐渐增大，而木聚糖含量变化不明显，Klason木质素的含量逐渐降低，去除率均在30%以上，最低为10.62%，比原料降低了50.23%。

表 4 液固比对预处理甘蔗渣成分的影响

图 4 液固比对预处理后甘蔗渣酶解(a)及发酵性能(b)影响

从图4(a)及4(b)可知，液固比虽然对葡聚糖的含量有较大的影响，但对酶解及发酵效率没有显著的影响，最高的发酵效率为58.26 %(液固比25∶1)，相应的酶解效率为63.08 %，比未处理的原料分别提高了6.27和8.05倍。

2.2 正交试验结果分析

在研究单因素对预处理效果影响的基础上，为了考察各因素间的交互作用，得出最优预处理条件，进行了L9(34)正交试验。正交试验设计及结果分析见表5。

表 5 正交试验设计及结果

1)酶解后还原糖质量与初始甘蔗渣质量的比值the mass ratio of reducing sugars after enzymolysis and initial SCB

由极差分析可知，3个因素对预处理效果影响大小依次为NaOH质量分数>温度>时间，正交试验的优化结果为：A3B2C3，即处理时间为11 h，温度为85 ℃，NaOH质量分数为4.5 %。在此条件下进行了3次实验，测得预处理后的甘蔗渣纤维素平均为56.46 %，较原料提高了46.16 %；半纤维素平均为20.30 %，较原料降低了15.77 %；Klason木质素平均为5.79 %，较原料降低了72.87 %。36 h 还原糖得率分别为0.66、 0.70和0.71 g/g，平均为0.69 g/g。

2.3 比表面积对酶解的影响

木质纤维原料的酶解速率和降解度与比表面积直接相关，比表面积越大，底物的可及性越高，所提供的酶接触位点越多[20]。比表面积由两部分组成，一是外部表观的表面积，二是由物料内部孔隙组成的表面积。Grethlein等[21]发现酶解初始速率与底物孔径分布呈线性正相关关系，并发现纤维素酶分子的直径为5.1 nm。Thompson等[22]在处理混合硬木时发现，在酶解反应最初2 h内葡萄糖的产量取决于底物的比表面积，而与预处理方式无关。刘淑瑞等[13]指出，比表面积能够直观地反映纤维之间的结合面积，比表面积越大，羟基越多，纤维素的亲水性越强，有利于纤维素酶的吸附。通过测定单因素试验中部分样品的比表面积的变化情况(数据未给出)，发现预处理甘蔗渣的比表面积均有显著增加，其中，由0.07 m2/g(未处理)最大增加到1.07 m2/g，增加了14.29倍。本研究对酶解初始速率与比表面积的关系进行了初步分析，并且进行了拟合，结果如图5所示。由图5可知，酶解初始速率及酶解效率(酶解72 h)都随着比表面的增大而增加，分别由0.31 g/(L·h)和7.84 %增加到3.72 g/(L·h)和63.4 %。而当比表面积超过0.30 m2/g时两者均达到平衡，可能是由于酶的添加量较少造成的。

2.4 木质素对酶解效率的影响

已有大量文献探讨木质素的去除与酶解的关系[19, 23-24]，Masarin等[19]指出当木质素去除率达到37%时，80 %的纤维素可以被降解。Lee等[23]研究了木粉中木质素的去除率和木粉酶解性能之间的关系，结果显示当40 %的木质素被萃取出时，90 %以上的纤维素即可被降解。Ko等[24]的研究表明去除20 %～65 %的木质素可以显著提高纤维素的降解性能。

图6显示了木质素含量对酶解效率(72 h)的影响。当木质素由18 %降至11 %时，酶解效率有显著的提高，从11 %提高至62 %。然而，当木质素低于11 %时，酶解效率达到平衡，基本不再变化。Nlewem等[25]在研究柳枝稷中残余木质素含量对酶解效果的影响时指出：可能存在最优的木质素含量使得酶解底物产生最大量的可发酵糖。

图 5 比表面积对酶解的影响

图 6 木质素对酶解效率的影响

3 结 论

3.1 氢氧化钠预处理可以显著提高甘蔗渣的酶解和发酵性能，氢氧化钠质量分数、预处理时间和预处理温度对预处理效果有较大影响，最佳预处理条件为：处理时间为11 h、温度为85 ℃、 NaOH质量分数为4.5 %。在此优化条件下处理的甘蔗渣，纤维素提高了46.16 %，木聚糖和Klason木质素分别降低了15.77 %和72.87 %，酶解36 h的还原糖得率为0.69 g/g。

3.2 氢氧化钠预处理后甘蔗渣比表面积显著增加(由原料的0.07 m2/g最大可增加到1.07 m2/g)，有利于酶解初始速率和酶解效率的提高，而当比表面积超过0.30 m2/g时，酶解效率达到平衡。

3.3 木质素含量的降低有助于酶解效率的提高，当木质素低于11 %时，酶解效率达到平衡。

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Impacts of NaOH Pretreatment on Enzymolysis and Fermentation Performance of Sugarcane Bagasse

ZHANG Xian-bao1， ZHANG Teng1， XIE Wen-hua2， ZHU Ming-jun1

(1. School of Bioscience and Bioengineering,South China University of Technology, Guangzhou 510006, China;2. Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute, Guangzhou 510316, China)

The impacts of different pretreatment conditions on enzymolysis and fermentation performance of sugarcane bagasse(SCB) pretreated by NaOH were investigated by single factor analysis and orthogonal experimental design.The effects of specific surface area and lignin content on enzymolysis of SCB were further studied.The results showed that the pretreatment temperature,time and mass fraction of NaOH significantly affected the enzymolysis and fermentation efficiency of the pretreated SCB.The optimal conditions for NaOH pretreatment were mass fraction of NaOH 4.5 %,11 h and 85 ℃.Under these conditions,the cellulose content of the pretreated SCB reached 56.46 % and increased by 46.16 % compared with the raw SCB. And the xylan and Klason lignin contents reached 20.30 % and 5.79 %,which decreased by 15.77 % and 72.87 %,respectively.The reducing sugar yield reached 0.69 g/g substrate after 36 h enzymolysis.The specific surface area of pretreated SCB significantly increased (the maximum value of 1.07 m2/g from 0.07 m2/g of the raw was obtained),while the lignin content decreased significantly.Both of them were beneficial for the enhancement of the enzymolysis and fermentation efficiency.It was found that when the specific surface area surpassed 0.30 m2/g,the initial enzymolysis rate and final efficiency could reach a balance.Besides,when the the lignin content was lower than 11 %,the enzymolysis efficiency reached a balance.

NaOH pretreatment;sugarcane bagasse;enzymolysis and fermentation

2016-03-08

国家自然科学基金资助项目(51278200， 51478190)；广东省自然科学基金重点项目(2014A030311014)

张宪宝(1988— )，男，山东泰安人，硕士，主要从事生物质能源研究工作

*通讯作者：朱明军(1969— )，男，教授，博士生导师，研究方向为纤维素酒精及工业废弃物综合利用；E-mail:mjzhu@scut.edu.cn。

10.3969/j.issn.1673-5854.2016.06.002

TQ35

A

1673-5854(2016)06-0009-08