藤本豆豆荚总黄酮提取及抗氧化活性研究

曹柏营，戚颖欣，姜秀娟，昌友权

（吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春130052）

藤本豆豆荚总黄酮提取及抗氧化活性研究

曹柏营，戚颖欣，姜秀娟，昌友权

（吉林工程技术师范学院食品工程学院，吉林长春130052）

利用响应面法优化藤本豆豆荚总黄酮提取工艺并进行体外抗氧化活性的评价。通过单因素试验选定提取时间、提取温度、料液比和乙醇浓度为考查因素，利用Box-Behnken进行试验设计，回归和方差分析结果显示，回归模型极显著（p<0.000 1），试验方法可信度较高。藤本豆豆荚总黄酮提取的最佳工艺如下：时间5 h，温度90℃，液料比1∶20（g/ mL），乙醇浓度60%。在此条件下藤本豆豆荚总黄酮的得率为6.42%。藤本豆豆荚总黄酮对ABTS+·（IC50=87.86μg/mL）和DPPH自由基（IC50=71.91μg/mL）具有一定的清除作用，对Fe3+具有较好的还原能力（相关系数R2=0.994），藤本豆豆荚总黄酮表现一定的体外抗氧化活性。

藤本豆豆荚；黄酮类化合物；响应面法；抗氧化活性

藤本豆是利用野生扁豆与大油豆杂交获得的豆科植物新品种，藤本豆中含有丰富的蛋白质、氨基酸和黄酮类化合物[1]。研究表明，藤本豆中的蛋白、多糖和多肽具有调节免疫、降低血清胆固醇和抗肿瘤的功效[2-3]，藤本豆中的黄酮类化合物具有一定的抗氧化活性，且与大豆的抗氧化活性呈显著差异（p<0.05）[4]。藤本豆豆荚是藤本豆加工过程中的废弃物，产量很大，一般作焚烧处理，另据报道植物豆荚中的黄酮类化合物含量比较丰富[5-9]。黄酮类化合物已报道了多种生物活性，如调节免疫、抗氧化、抗肿瘤、降血脂等[10-14]。藤本豆豆荚中黄酮类化合物的开发，可以改善生态环境，变废为宝，提高藤本豆的附加值。因此，本论文以藤本豆豆荚为原料提取总黄酮，对其抗氧化活性进行评价，为藤本豆资源的综合利用及新资源食品的开发提供重要的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

藤本豆豆荚采自福建省永春县岵山镇藤本豆种植示范基地，采后自然晾干，临用时烘箱（60℃）干燥、粉碎、过筛（80目）备用。

1.2 试剂

DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）：sigma；ABTS [2，2'氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐]：am－

resco；芦丁标准品：中国药品生物制品鉴定所；硝酸铝、亚硝酸钠、三氯化铁、邻苯三酚、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯乙酸均为分析纯。

1.3 仪器

UV-1700紫外可见分光光度计：日本岛津公司；WFJ2100可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；PL203电子天平：上海梅特勒-托利多仪器公司；雷磁ZD-2自动电位滴定仪：上海雷磁有限公司；H.H. KW-1000DC数显电热恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司；FW177中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；RE52-99旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂。

1.4 方法

1.4.1 芦丁标准曲线的绘制

芦丁标准曲线的绘制参照郑媛媛的方法[15]。线性回归得到标准曲线方程为：y=6.179x+0.011（R2=0.996）。芦丁标样浓度在0.001 6mg/mL～0.019 2mg/mL范围内，芦丁浓度与吸光度呈线性关系。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

1.4.2 藤本豆豆荚总黄酮得率的测定

藤本豆豆荚总黄酮得率测定方法参照1.4.1。根据标准曲线计算藤本豆豆荚总黄酮得率。

式中：A为吸光度值；M为称取样品质量，g。

1.4.3 藤本豆豆荚总黄酮提取工艺优化

单因素试验分别考查温度、料液比、时间、乙醇浓度和pH值对藤本豆豆荚总黄酮得率的影响，选取影响得率的主要因素，即时间、温度、料液比和乙醇浓度为考查变量，以总黄酮得率为响应值，进行 Box-Behnken试验设计。试验因素水平编码见表1。

表1 试验因素水平编码表Table1 The factorsand levelsof RSM

1.4.4 藤本豆豆荚总黄酮的纯化

选用AB-8树脂对藤本豆豆荚总黄酮粗提物进行纯化，处理后的树脂装入层析柱（5 cm×60 cm），上样流速为2BV/h，60%（体积分数）乙醇水溶液为洗脱剂，流速为2BV/h。纯化后冻干备用。

1.4.5 藤本豆豆荚总黄酮的体外抗氧化活性测定

1.4.5.1 ABTS+·清除能力测定

参照陈飞[16]的试验方法。

1.4.5.2 DPPH·清除能力的测定

参照刘香萍[17]的试验方法。

1.4.5.3 Fe3+还原能力的测定

参照储维维[18]的试验方法。

1.5 数据处理

所有试验数据均以X±SD表达，方差分析采用SPSS（19.0）软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取温度对藤本豆豆荚总黄酮得率的影响

提取温度对藤本豆豆荚总黄酮得率的影响见图2。

图2 提取温度对藤本豆豆荚总黄酮得率的影响Fig.2 Theeffectsof extraction temperatureon yield of FPLH

由图2可知，随着提取温度的升高，藤本豆豆荚总黄酮的得率逐渐增加，提取温度达到90℃时藤本豆豆荚总黄酮得率达到6.61%，此后温度升高，藤本豆豆荚总黄酮得率降低。温度过高可能破坏黄酮类化合物的结构，影响得率。

2.1.2 料液比对藤本豆豆荚黄酮得率的影响

料液比对藤本豆豆荚黄酮得率的影响见图3。

图3可知，随料液比的增大，藤本豆豆荚总黄酮得率先增加后减少，当料液比为1∶20（g/mL）时藤本豆豆荚总黄酮得率达到最大为5.47%。

2.1.3 提取时间对藤本豆豆荚总黄酮得率的影响

提取时间对藤本豆豆荚总黄酮得率的影响见图4。

图3 料液比对藤本豆豆荚总黄酮得率的影响Fig.3 Theeffectsof ratio of liquid to solid on yield of FPLH

图4 提取时间对藤本豆豆荚总黄酮得率的影响Fig.4 Theeffectsofextraction timeon yield of FPLH

由图4可知，随着提取时间的延长，藤本豆豆荚总黄酮的得率逐渐增加，当达到6 h以后出现下降趋势，提取时间为5 h藤本豆豆荚总黄酮得率达到最大为5.64%。

2.1.4 乙醇浓度对藤本豆豆荚总黄酮得率的影响

乙醇浓度对藤本豆豆荚总黄酮得率的影响见图5。

图5 乙醇浓度对藤本豆豆荚总黄酮得率的影响Fig.5 Theeffectsof ethanolconcentration on yield of FPLH

由图5可知，随着乙醇浓度的增大，藤本豆豆荚总黄酮得率先增大后减小，当乙醇浓度为60%时藤本豆豆荚总黄酮得率达到最大为5.78%。

2.1.5 pH值对藤本豆豆荚总黄酮提取率的影响

pH值对藤本豆豆荚总黄酮提取率的影响见图6。

图6 pH值对藤本豆豆荚总黄酮得率的影响Fig.6 Theeffectsof pH valueon yield of FPLH

由图6可知，pH值增大藤本豆豆荚总黄酮的含量有所增加，当pH值为9时黄酮的得率最大为5.54%，但藤本豆豆荚总黄酮得率的变化率较小，pH值对藤本豆豆荚总黄酮得率的影响较小，工艺优化过程中未考虑pH值的影响。

2.2 响应面试验方案及结果

2.2.1 试验方案及结果分析

利用Design Expert 8.0软件进行回归和方差分析，建立数学模型，获得藤本豆豆荚总黄酮提取最佳工艺，试验方案及结果见表2。

表2 试验方案及试验结果Table2 Design and resultsof tests

续表2 试验方案及试验结果Continue table2 Design and resultsof tests

2.2.2 模型的建立及其显著性检验[17]

利用多项拟合回归，得到藤本豆豆荚总黄酮得率对提取温度、提取时间、料液比、乙醇浓度的二次多项回归模型为：Y=6.288-0.026 667X1+0.121 67X2+ 0.019 167X3-0.015 833X4+0.147 5X1X2-0.11X1X3-0.132 5X1X4-0.172 5X2X3+0.15X2X4-0.025X3X4-0.404 42X12-0.466 92X22-0.495 67X32-0.363 17X42。方差分析结果见表3。

表3 回归模型分析Table3 Theanalysisof regressionm odel

由表3可见，回归方程模型极显著（p＜0.000 1），试验方法可信度较高；一次项X2差异显著（p＜0.05）；交互项X2X3差异显著（p＜0.05），二次项X12、X22、X32、X42差异极显著（p＜0.01），试验因素与响应值之间的关系不是简单的线性关系。试验因素对藤本豆豆荚总黄酮得率影响顺序为：时间＞温度＞料液比＞乙醇浓度。

2.2.3 最优工艺条件求取与验证

Design Expert8.0软件分析得到的最优提取工艺如下：时间5.3 h，温度90℃，料液比1∶20.3（g/mL），乙醇浓度59.5%；藤本豆豆荚总黄酮得率的理论值可达到6.53%。修正后藤本豆豆荚总黄酮提取最优工艺如下：时间5 h，温度90℃，料液比1∶20（g/mL），乙醇浓度60%。在最优工艺下重复提取藤本豆豆荚总黄酮5次进行验证，得到的藤本豆豆荚总黄酮的平均得率为6.42%，与理论值吻合较好。

2.3 藤本豆豆荚总黄酮纯化

提取制备的藤本豆豆荚总黄酮经AB-8大孔吸附树脂纯化后，总黄酮纯度达到35.73%。

2.4 藤本豆豆荚总黄酮体外抗氧化活性测定结果

2.4.1 藤本豆豆荚总黄酮对ABTS+·清除能力

藤本豆豆荚总黄酮对ABTS+·清除率的影响见图7。

图7 藤本豆豆荚总黄酮对ABTS+·的清除作用Fig.7 ABTS+radicalscavenging ability of FPLH

由图7可见，在不同质量浓度时，藤本豆豆荚总黄酮对ABTS自由基的清除率（IC50=87.86μg/mL）弱于VC（IC50=33.99μg/mL），但藤本豆豆荚总黄酮浓度在10μg/mL～160μg/mL内对ABTS自由基清除率逐渐增大，超过160μg/mL后，对ABTS+·的清除率增加不明显，黄酮浓度为200μg/mL时清除率最大为84.26%，对ABTS+·的清除能力与四齿四棱草总黄酮相同[18]。

2.4.2 藤本豆豆荚总黄酮对DPPH·清除能力

藤本豆豆荚总黄酮对DPPH自由基清除率的影响见图8。

由图8可见，在不同浓度时，藤本豆豆荚总黄酮对DPPH自由基的清除率（IC50=71.91μg/mL）弱于VC（IC50=32.01μg/mL），但藤本豆豆荚总黄酮浓度在10μg/mL～140μg/mL内对DPPH自由基清除率逐渐增大，超过140μg/mL后，对DPPH·的清除率增加不显

著，总黄酮浓度为200μg/mL时清除率最大为91.24%，DPPH·清除能力与内蒙紫草总黄酮相同[19]。

图8 藤本豆豆荚总黄酮对DPPH·的清除作用Fig.8 DPPH radicalscavenging ability of FPLH

2.4.3 藤本豆豆荚总黄酮的还原能力

藤本豆豆荚总黄酮的还原力见图9。

图9 藤本豆豆荚总黄酮的还原力Fig.9 The reducing power of FPLH

由图9可见，在不同质量浓度时，藤本豆豆荚总黄酮的还原力逐渐增强（吸光度增大），试验结果经线性回归，其相关系数R2=0.994。但藤本豆豆荚总黄酮的还原力弱于VC，这与藤本豆黄酮的还原力相同[4]。

3 结论

通过单因素和Box-Behnken试验设计优化了藤本豆豆荚总黄酮提取的最优工艺，回归和方差分析结果表明，模型方程极显著（p＜0.000 1），各试验因素对总黄酮得率影响的顺序为：时间＞温度＞料液比＞乙醇浓度。藤本豆豆荚总黄酮最佳提取工艺如下：时间5 h，温度90℃，液料比1∶20（g/mL），乙醇浓度60%。5次验证试验的总黄酮平均得率为6.42%，与预测值基本吻合。

体外抗氧化试验结果表明，藤本豆豆荚总黄酮浓度在10μg/mL～160μg/mL内对ABTS+·清除率逐渐增大，至200μg/mL时清除率最大为84.26%；藤本豆豆荚总黄酮黄酮浓度在10μg/mL～140μg/mL内对DPPH自由基清除率逐渐增大，至200μg/mL时清除率最大为91.24%；藤本豆豆荚总黄酮对Fe3+具有一定的还原能力，线性回归的相关系数R2=0.994。藤本豆豆荚总黄酮表现一定的体外抗氧化活性。藤本豆豆荚总黄酮的进一步分离纯化及动物体内抗氧化活性的评价是课题下一步研究的重点。

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Study on Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavonoids from Perennial lablab sp.Hull

CAOBai-ying，QIYing-xin，JIANGXiu-juan，CHANGYou-quan
（Food Engineering College of Jilin Engineering NormalUniversity，Changchun 130052，Jilin，China）

The response surfacemethodologywasutilized to optimize extraction processof total flavonoids from Perennial lablab sp.hull（FPLH）and its antioxidantactivitywere studied.Through single experiments，extraction time，extraction temperature，ratio of liquid to solid and ethanol concentration were selected for Box-Behnken central composite designing．The results of regression and ANOVA revealed that the regressionmodel for total flavonoids yield exhibited tremendous significance（p<0.000 1）.The optimal extraction processwere time5 hours，temperature 90℃，ratio of liquid to solid 1∶20（g/mL）and ethanol concentration 60%.The yield of FPLH was up to 6.42%.The antioxidant tests results indicated that scavenging capacity（IC50）of total flavonoids towardsABTS+·and DPPH·were87.86μg/mLand 71.91μg/mL，respectively.FPLH showed strong reducing power towards Fe3+（R2=0.994）.FPLH showed strongantioxidantactivity in vitro.

Perennial lablab sp.hull；flavonoids；response surfacemethodology；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.014

2016-08-09

吉林省教育厅十二五科技规划项目（吉教科合字2013第369号）

曹柏营（1979—），男（汉），讲师，硕士，研究方向：天然产物研究与开发。