青砖茶清除DPPH·能力及其多酚和黄酮含量研究

杨新河，吕帮玉，黄明军，4，斯琴朝克图，毛清黎，刘仲华，*

（1.湖北工程学院生命科学技术学院，湖北孝感432000；2.湖北省植物功能成分利用工程技术研究中心，湖北孝感432000；3.特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北孝感432000；4.湖北大学生命科学学院，湖北武汉430062）

青砖茶清除DPPH·能力及其多酚和黄酮含量研究

杨新河1，2，3，吕帮玉1，2，黄明军1，2，4，斯琴朝克图1，2，毛清黎1，2，刘仲华1，2，*

（1.湖北工程学院生命科学技术学院，湖北孝感432000；2.湖北省植物功能成分利用工程技术研究中心，湖北孝感432000；3.特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北孝感432000；4.湖北大学生命科学学院，湖北武汉430062）

采用DPPH自由基（DPPH·）清除法测定了18个青砖茶样品的抗氧化活性，并按照GB/T 8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》方法和亚硝酸钠-硝酸铝比色法分别测定它们的多酚和黄酮含量。结果表明：18个青砖茶水提取物均能清除DPPH·，具有抗氧化活性，它们的浓度（0.05mg/mL～0.30mg/mL）与DPPH·清除率之间具有良好的线性关系，二者的相关系数介于0.9742～0.9945，且清除DPPH·的IC50最大值为0.2586mg/mL，最小值为0.1144mg/mL；多酚和黄酮含量的最高值分别为3.57%和3.84%，最低值分别为2.06%和1.01%；青砖茶清除DPPH·的IC50与多酚和黄酮含量的相关系数分别为0.684和0.715。

青砖茶；DPPH自由基；多酚；黄酮

青砖茶以老青茶为原料，经渥堆、压制定型、烘房干燥等工序加工而成，属于西北高寒高脂饮食地区人们的生活必需品。其品质特征为色泽青褐、内质香气纯正无青气、滋味纯正、汤色深黄红稍亮、叶底暗褐呈猪肝色。由于黑茶对糖脂代谢性疾病具有良好的保健效果[1-7]，成为当今茶叶消费的新热点，而青砖茶作为黑茶家族的主要成员和湖北特有的黑茶，迎来了很好的发展机遇。

伴随着自由基生物医学的快速发展和广大公众健康意识的不断提高，自由基与多种疾病的关系已愈来愈被重视，积极探寻高效低毒的自由基清除剂—天然抗氧化剂成为生物化学和医药学的研究热点。而抗氧化作用被认为是茶保健抗癌作用最重要的机制。关于茶的抗氧化作用研究集中在红茶、绿茶、乌龙茶和普洱茶，且茶多酚及其衍生产物被认为它们抗氧化作用的特征成分，然而青砖茶的体外抗氧化作用几乎未被研究。本研究采用常用的体外DPPH自由基（DPPH·）清除法评价来源与年份不同的18个青砖茶的抗氧化活性，并按照GB/T 8313-2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》方法和亚硝酸钠-硝酸铝比色法分别测定它们的多酚和黄酮含量，以期初步探明青砖茶抗氧化活性能力及其与多酚和黄酮含量的相关性，为青砖茶的进一步研究与综合加工利用提供重要参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

该试验采用的青砖茶成品样分别来源于湖北省赵李桥茶厂有限责任公司、湖北省羊楼洞生态茶业有限公司、湖北洞庄茶厂和湖南永巨茶业有限公司，共计18个青砖茶样品编号Q1～Q18。

1.2 试剂

1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；福林酚试剂、没食子酸、芦丁、VC、碳酸钠、甲醇、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠等：购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器

752紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；AL104电子天平：梅特勒托利多仪器（上海）公司；DT5-2型低速台式离心机：北京时代北利离心机有限公司；101A-3型数显鼓风干燥箱：上海新诺仪器设备有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：江苏省金坛市友联仪器研究所。

1.4 方法

1.4.1 青砖茶提取液的制备

称取已干燥的2 g（准确至0.001 g）磨碎试样于500mL锥形瓶中，加沸蒸馏水300mL，立即移入沸水浴中，浸提45min（每隔10min摇动一次）。浸提完毕后立即趁热减压过滤，滤液定容至500mL，备用。

1.4.2 青砖茶清除DPPH·能力测定

参照文献[8]，分别取不同浓度（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mg/mL）青砖茶提取液2mL于试管中，加入2mL 2×10-4mol/LDPPH溶液（无水乙醇配制），混合均匀，室温下暗处静置30min后，以2mL水与2mL无水乙醇的混合液调零点在波长518 nm处测定其吸光度A1，以2mL水代替提取液与2mLDPPH溶液混合反应后测定其吸光度A0，以2mL提取液与2mL无水乙醇混合液测定其吸光度A2，以消除提取液本身的影响。以维生素C作为清除DPPH·的阳性对照品。按以下公式计算不同浓度青砖茶提取液对DPPH·清除率：

DPPH·清除率/%=[1－（A1－A2）/A0]×100，求出青砖茶浓度与DPPH·清除率的线性回归方程，然后计算得到青砖茶清除DPPH·的IC50。

1.4.3 青砖茶中多酚含量测定

按照GB/T 8313-2008方法进行。以没食子酸为标准物，经测定计算得到标准曲线方程为Y=0.011 1X-0.002 1，r=0.998 8，式中：Y为吸光值；X为多酚浓度，μg/mL。称取干燥的茶样品0.2000g（精确到0.0001g），放入10mL离心管中，加入70℃预热的5mL 70%甲醇溶液，涡旋混匀后于70℃水浴锅中浸提10min，以每2 min搅拌1次，浸提完毕冷却至室温，以转速3 500 r/min离心10min，过滤得到滤液，滤渣按照上述方法再浸提1次，过滤，合并两次滤液并用70%甲醇定容至10mL，摇匀后于24 h内测定多酚浓度，经计算得到样品中多酚含量。

1.4.4 青砖茶中黄酮含量测定

按照亚硝酸钠-硝酸铝法方法进行。以芦丁为标准物，经测定计算得到标准曲线方程为Y=1.062 4X+ 0.035 7，r=0.999 4，式中：Y为吸光值；X为黄酮质量，mg。称取干燥的茶样品0.5 g（精确到0.000 1 g），放入10mL具塞锥形瓶中，加入70%乙醇5mL，在室温下用超声波振荡浸提20min，将提取液过滤至25mL容量瓶中，滤渣按照上述方法重复浸提两次过滤，合并滤液后用70%乙醇定容至25mL。接着取滤液0.5mL于容量瓶中，加入4.5mL蒸馏水至体积为5mL，加入0.3mL 10%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6min；加0.3mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，静置6min；加4mL 4%氢氧化钠

溶液，再用蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置15min。在510nm处测定吸光值代入标准曲线方程得到0.5mL滤液中黄酮质量，经计算得到样品中黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 青砖茶水提取物清除DPPH·能力

青砖茶水提取物清除DPPH·能力的测定结果见表1。

表1 青砖茶水提取物清除DPPH·能力Tab le1 Scavenging capacity ofwater extractof Qingzhuan brick tea on DPPH free radical

由表1可知，青砖茶各样品水提取物能清除DPPH·，并且它们的浓度介于0.05mg/mL～0.30mg/mL时，清除DPPH·能力随着浓度的增加而增强，与DPPH·清除率呈现出良好的线性关系，二者的相关系数介于0.974 2～0.994 5。青砖茶样品的水提取物对DPPH·清除率以Q5样品的IC500.114 4mg/mL最小，以Q13样品的IC500.258 6mg/mL最大，均大于阳性对照品VC的IC500.011 1mg/mL，但清除DPPH·的IC50与其生产单位及年份之间无明显的关联性。

2.2 青砖茶中多酚与黄酮含量

茶多酚为一类含有多酚羟基的化学物质，能清除体内活性自由基，具有很强的抗氧化作用，在食品行业、医药行业具有广阔的应用前景。青砖茶中多酚含量的测定结果见图1。

图1 青砖茶中多酚含量Fig.1 Contentsof polyphenolsof Qingzhuan brick tea

由图1可知，多酚含量以青砖茶样品Q9中最高，为3.57%；样品Q15中的最低，为2.06%。

黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，以其广谱的药理作用引人瞩目，也是茶叶中的主要功效成分。青砖茶中黄酮含量的测定结果见图2。

图2 青砖茶中黄酮含量Fig.2 Contentsof flavonoidsof Qingzhuan brick tea

由图2可知，黄酮含量以青砖茶样品Q9中最高，为3.84%；样品Q1中最低，为1.01%。

从图1和图2还可知，同一生产单位青砖茶中多酚和黄酮含量与其年份并没有直接的关系；同一年份不同生产单位的青砖茶中多酚和黄酮含量均不同。

2.3 青砖茶清除DPPH·的IC50与多酚和黄酮含量的关系

对青砖茶清除DPPH·的IC50与其多酚含量进行统计分析表明，青砖茶清除DPPH·的IC50Y（mg/mL）与其多酚含量X（%）的相关性见图3所示。

图3 青砖茶清除DPPH·的IC50与其多酚含量的相关性Fig.3 Correlation of scavenging DPPH·with IC50and polyphenols contentsof Qingzhuan brick tea

由图3可知，二者的线性回归方程为Y=-0.056 8X+ 0.305 5，相关系数（r）=0.684，提示青砖茶清除DPPH·的IC50与其多酚含量之间具有相关性。

对青砖茶清除DPPH·的IC50与其黄酮含量进行统计分析表明，青砖茶清除DPPH·的IC50Y（mg/mL）与其黄酮含量X（%）的相关性见图4所示。

图4 青砖茶清除DPPH·的IC50与其黄酮含量的相关性Fig.4 Correlation of scavenging DPPH·with IC50and flavonoids contentsof Qingzhuan brick tea

由图4可知，二者的线性回归方程为Y=-0.0347X+ 0.233 6，相关系数（r）=0.715，提示青砖茶清除DPPH·的IC50与其黄酮含量之间具有相关性，且略高于青砖茶清除DPPH·的IC50与其多酚含量的相关性。

3 讨论

DPPH·是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能清除它，则提示受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。根据在DPPH溶液中加入自由基清除剂使稳定的有机DPPH·的单电子配对，在DPPH·强吸收波长517 nm处的吸光度变小，颜色变浅，且这种颜色的变浅程度与配对电子数成剂量关系[9]。因此，可通过测定波长517 nm处的吸光度来评价自由基被清除的情况，从而评价试验样品的抗氧化能力。DPPH法有稳定性好、灵敏度高、操作简单等优点[10-11]。DPPH法已在全世界范围内被广泛用于自由基清除能力的定量分析[12]。本研究表明，青砖茶各样品水提取物具有抗氧化作用，对DPPH·有一定的清除作用。这与陈玉琼等[6]研究表明青砖茶能增强机体抗氧化能力相一致。

近年来，多酚类和黄酮类物质成为人们关注的热点。本研究进行了18个青砖茶样品中多酚和黄酮含量的检测，结果表明，青砖茶中多酚的平均含量介于2.06%～3.57%，而罗堃等采用Folin-Ciocalteu比色法测定3批安化黑茶中茶多酚的平均含量为2.49%[13]，说明同属于黑茶类，且对原料老嫩要求及加工关键工序渥堆相同的青砖茶与安化黑茶中茶多酚含量较接近；青砖茶中黄酮的平均含量介于1.01%～3.84%，均高于侯冬岩报道的陈年8年熟普洱中黄酮类化合物的含量[14]。此外，经过进一步测定发现，青砖茶各样品的含梗量、碳水化合物含量、水浸出含量等指标及感官评审等方面存在差异，有待提升并落实青砖茶种植、采摘、加工等环节的标准。

多酚类物质是抗氧化性物质中最大的一类，普遍存在于植物界。关于多酚含量与抗氧化能力之间的关系已有两种截然不同的观点：Yang等认为二者之间存在显著的相关性[15]，而Ismail等认为二者之间没有相关性[16]。而本研究结果表明，青砖茶中多酚含量与清除DPPH·的IC50之间具有一定的相关性，相关系数为0.684，提示多酚对青砖茶清除DPPH·发挥了积极的作用。另外，黄酮类物质是预防型和阻断型抗氧化剂。张红雨等用AMI方法对若干黄酮类抗氧化剂做了计算，发现黄酮化合物邻二酚羟基清除自由基的活性强于间二酚羟基，总结解释出B环酚羟基活性高的规律[17]，而青砖茶中黄酮含量与清除DPPH·的IC50之间呈现出相关性，且相关系数达到0.715。因此，青砖茶中黄酮类化合物结构与清除DPPH·的关系有待进一步研究。

4 结论

青砖茶各样品水提取物浓度（0.05mg/mL～0.30mg/ mL）与DPPH·清除率之间具有良好的线性关系，二者的相关系数（r）介于0.974 2～0.994 5，且清除DPPH·的IC50在0.114 4mg/mL～0.258 6mg/mL之间；青砖茶中多酚和黄酮含量分别介于3.57%～2.06%和3.84%～1.01%之间，且青砖茶清除DPPH·的IC50与多酚和黄酮含量的相关系数分别为0.684和0.715；青砖茶具有作为天然抗氧化剂和功能性食品开发的潜力。

[1]SONG J L,GAO Y.Effects of methanolic extract form Fuzhuan brick-tea on hydrogen peroxide-induced oxidative stress in human intestinal epithelial adenocarcinoma Caco-2 cells[J].Molecular MedicineReports,2014,9(3):1061-1067

[2]CAO ZH,GUD H,LINQY,etal.Effectof pu-erh tea on body fat and lipid profiles in ratswith diet-induced obesity[J].Phytotherapy Research,2011,25(2):234-238

[3]YUANH B,ZHONG J,YIJ,etal.EffectofPu-Erh teaon lipogenesisand expression of relativegenes in obese rats fed with high fatdiet[J].Acta Nutrimenta Sinica,2009,31(2):167-171

[4]杨新河.普洱茶色素提取、分级及生物活性研究[D].长沙:湖南农业大学,2011

[5]熊昌云,屠幼英,欧阳梅,等.人工接种发酵茯砖茶降脂减肥作用研究[J].菌物学报,2011,30(2):349-354

[6] 陈玉琼,张伟,倪德江,等.湖北青砖茶辅助降血脂作用及其抗氧化效果[J].茶叶科学,2010,30(2):124-128

[7]LIQ,LIU ZH,HUANG JA,etal.Anti-obesity and hypolipidemic effectsof Fuzhuan brick teawater extract in high-fat diet-induced obese rats[J].Journal of the science of food and agriculture,2013,93 (6):1310-1316

[8]Vattem D A,LIN Y T,Labber RG,etal.Phenolic antioxidantmobilization in cranberry pomaceby solid-statebioprocessing using food grade fungus Lentinusedodesand effecton antimicrobialactivity against select food borne pathogens[J].Innovative Food Science and Emergin Technologies,2004,5(1):81-91

[9]陈玉霞,刘建华,林峰,等.DPPH和FRAP法测定41种中草药抗氧化活性[J].实验室研究与探索,2011,30(6):11-14

[10]JIN Jie,LIZhixi,ZHANG Feng.Scavenging function ofmulberry vinegar extractives for 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)[J]. Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry,2006,34(3):135-137

[11]OZCELIK B,LEE JH,MIND B.Effectsof light,oxygen and pH on theabsorbanceof2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl[J].Journalof Food Science,2003,68(2):487-490

[12]SCHERERR,GODOY H T.Antioxidantactivity index(AAI)by the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylmethod[J].Food Chemistry,2009, 112(3):654-658

[13]罗堃,何群,葛云鹏,等.Folin-Ciocalteu比色法测定安化黑茶中茶多酚的含量[J].湖南中医药大学,2013,33(5):65-66

[14]侯冬岩,回瑞华,刘晓媛,等.黑茶黄酮的光谱分析及抗氧化性能研究[J].鞍山师范学院学报,2009,11(4):21-24

[15]YANG JH,LIN H C,MAU JL.Antioxidant properties of several commercialmushrooms[J].Food Chem,2002,77(2):229-235

[16]Ismail A,Marjan ZM,Foong CW.Total antioxidant activity and phenolic content in selected vegetables[J].Food Chem,2004,87(4): 581-586

[17]张红雨.黄酮类抗氧化剂结构-活性关系的理论解释[J].中国科学(B辑),1999,29(1):91-96

Studies on DPPH Free Radical Scavenging Capacity and Polyphenols and Flavonoids Contents of Qingzhuan Brick Tea

YANGXin-he1，2，3，LÜBang-yu1，2，HUANGMing-jun1，2，4，SIQinchaoketu1，2，MAOQing-li1，2，LIU Zhong-hua1，2，*
（1.Schoolof Life Scienceand Technology，HubeiEngineering University，Xiaogan 432000，Hubei，China；2.HubeiProvincialResearch Centerof Engineering Technology for Utilization ofBotanical Functional Ingredients，Xiaogan 432000，Hubei，China；3.HubeiKey Laboratory ofQuality ControlofCharacteristic Ftuitsand Vegetables，Xiaogan 432000，Hubei，China；4.College of Life Science，HubeiUniversity，Wuhan 430062，Hubei，China）

DPPH method was used to determine the antioxidant activities of eighteen samples of Qingzhuan brick tea.According to the GB/T 8313-2008 method and Sodium nitrite-aluminum nitrate colorimetric method，contents of polyphenols and flavonoids of Qingzhuan brick teawere determined.Resultsshowed thatwaterextractsofallsamplesexhibited theantioxidant activity，a good linear relationship with the correlation coefficient ranging from 0.974 2 to 0.994 5 was existed between their concentrations ranging from 0.05mg/mL to 0.30mg/mL and DPPH free radical scavenging ratio，and the IC50maximum and minimum values of DPPH free radical scavenging capacity for Qingzhuan brick tea were 0.258 6mg/mL and 0.114 4mg/mL.Polyphenols contentwas between 3.57%and 2.06%，and flavonoids content between 3.84%and 1.01%.Correlation coefficient of scavenging DPPH·with IC50and contents of polyphenolsand flavonoidswere0.684 and 0.715，respectively.

Qingzhuanbrick tea；DPPH free radical；polyphenols；flavonoids

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.001

2016-02-18

国家自然科学基金资助项目（31370692；31370691）；湖北省自然科学基金面上项目（2014CFB573）

杨新河（1974—），男（汉），副教授，博士，研究方向：茶及功能食品化学。

*通信作者：刘仲华（1965—），男（汉），教授，博士，研究方向：茶及功能食品化学。