超高效液相色谱-串联质谱法检测双黄连口服液中3种有效成分

刘雪红，侯 颖，乔 颖，李 娜，宋 平，陈 玲，曲悠扬，张艺多

（辽宁省大连市兽药饲料监察所，辽宁 大连 116037）

超高效液相色谱-串联质谱法检测双黄连口服液中3种有效成分

刘雪红，侯 颖，乔 颖，李 娜，宋 平，陈 玲，曲悠扬，张艺多

（辽宁省大连市兽药饲料监察所，辽宁 大连 116037）

应用超高效液相色谱-串联质谱技术，建立了同时测定双黄连口服液中3种有效成分（黄芩苷、绿原酸、连翘苷）的检测方法。采用BEH C18色谱柱，以0.2%甲酸-乙腈作为流动相进行梯度洗脱。在ESI负离子模式下，通过多反应监测模式进行测定。黄芩苷、绿原酸、连翘苷的线性范围分别为0.02～10 μg/mL（r=0.9991）、0.02～10 μg/mL（r=0.9998）、0.025～10 μg/mL（r=0.9996）。定量限分别为0.02 mg/kg、0.02 mg/kg、0.025 mg/kg。3种成分的回收率为98%～101.7%，相对标准偏差均小于2.5%。该法快捷、准确、重复性好，可用于双黄连口服液中的3种有效成分含量的同时测定。

双黄连口服液；黄芩苷；绿原酸；连翘苷；超高效液相色谱-串联质谱

双黄连口服液是由金银花、黄芩、连翘3种清热中药制备而成的合剂，具有辛凉解表、清热解毒功效[1]。其中黄芩苷、绿原酸、连翘苷是其主要活性成分。中华人民共和国兽药典（2010年版）中规定，质控成分分别采取3种不同的H PLC色谱条件检测，供试品溶液制备方法繁琐。目前，已有文献报道以

高效液相色谱法同时测定黄芩苷、绿原酸、连翘苷的含量[2-3]。另有文献报道在双黄连的其他制剂（胶囊、粉针剂等）中利用高效液相色谱-质谱联用技术同时测定此3种成分[4-6]。本文采用超高效液相色谱-串联质谱技术，建立了同时测定双黄连口服液中黄芩苷、绿原酸和连翘苷3种有效成分含量的方法。该方法简便、快速、灵敏度高、重现性好。

1 试验材料

1.1 仪器与设备电子天平RD-200，德国Sartorius公司；超声波清洗机KQ-250B，昆山市超声仪器有限公司；XEVO TQ-S ACQUITY UPLC 超高效液相色谱-串联质谱仪，配置电喷雾离子源，美国Waters公司；色谱柱BEH C18 2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters公司。

1.2 试剂 乙腈、甲酸、甲醇、均为色谱纯；水为符合GB/T 6682规定的一级水。

1.3 对照品 黄芩苷（批号110715-201318，含量93.3%）、绿原酸（批号 110753-201314，含量96.6%）、连翘苷（批号 110821-201213，含量95.3%），均购置于中国食品药品检定研究院。

1.4 供试品 双黄连口服液，A公司，批号20131109、20140121；B公司，批号1409091；C公司，批号201312103、201409015。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品贮备液的配制 准确称取黄芩苷、绿原酸、连翘苷对照品各25 m g，50%甲醇定容至25 mL，混匀，即为1 000 μg/mL的对照品贮备液；有效期为3个月。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密量取供试品1 mL，置100 mL容量瓶中，加入30 mL 50%甲醇，超声5 min，定容至100 mL；精密量取1 mL，加 0.2%甲酸-乙腈（90:10）溶液，定容至100 mL，过0.22 μm滤膜后，上机待测。

2.1.3 标准曲线配制 分别精密量取对照品贮备液适量，以0.2%甲酸-乙腈（90:10）溶液稀释，配制成质量浓度为0.02、0.10、0.50、2.50、10.00 μg/mL的黄芩苷系列溶液；质量浓度为0.02、0.10、0.50、2.50、10.00 μg/mL的绿原酸系列溶液；质量浓度为0.025、0.10、0.50、2.50、10.00 μg/mL的连翘苷系列溶液。

2.2 液相色谱条件 柱温：30℃，进样量：5 μL，流动相：乙腈、0.2%甲酸，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table1 Program of gradient elution

2.3 质谱条件 离子扫描方式：负离子，检测方式：多反应监测，雾化器压力：0.7 M Pa，干燥气流量：850 L/h，干燥气温度：550℃，毛细管电压：3 000 V。定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞能量见表2，二级质谱见图1。

表2 3种对照品的质谱分析参数Table2 MS/MS parameters of the three standards

图1 3种成分对照品的二级质谱Fig.1 Two stage mass spactraof three standards

2.4 线性关系与检测限 以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，得线性方程和相关系数，见表3。根据特征质量色谱峰的信躁比S/N＞3为检测限，信躁比S/ N＞10为定量限，得到3种对照品的检测限和定量限，见表3。

表3 3种对照品的线性方程、相关系数、线性范围、检测限及定量限Table3 Regression equations、 linear ranges、correlation coefficients、detection limits、quantification limits of the three standards

对照品和供试品溶液的特征离子质量色谱图见图2。

2.5 稳定性试验 取同一供试品溶液（A公司，批号20131109），分别存放0、4、8、12、16、24 h后测定，记录峰面积，测得绿原酸、连翘苷和黄芩苷含量的RSD均小于2.3%，结果表明，样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验 精密量取同一批号供试品（A公司，批号20131109）6份，按2.1.2准备测试液，分别进样5 μL，记录峰面积，测得绿原酸、连翘苷和黄芩苷含量的RSD分别为2.5%、2.1%和2.0%，表明该方法的重复性较好。

图2 对照品和双黄连口服液样品的特征离子质量色谱图Fig.2 MRM chromatograms of standardh and sample

表4 回收率试验结果（n=3）Table4 Results of recovery

2.7 回收率试验 采用加标法进行回收率的考察。精密量取供试品（A公司，批号20131109）1 mL共9份，3份为一组，以3个不同质量浓度分别加入对照品溶液，按2.1.2准备测试液，分别进行测定，计算回收率，3种成分的平均回收率见表4。从表中试验结果可以看出3种药物的添加回收率在98%～101.7%之间，相对标准偏差RSD均小于2.5%。

2.8 样品测定 取不同批号供试品，按所建立的方法进行处理和测定，外标法计算。同时与采用中国兽药典2010年版二部收载的高效液相色谱法测定的结果进行比较，2种方法测定结果基本一致，见表5。

表5 2种方法含量测定结果比较Table5 Determination results of comparision of the two methods

3 讨论

3.1 进样溶液的选择 比较0.2%甲酸-乙腈（90:10）溶液、50%甲醇为进样溶液。采用0.2%甲酸-乙腈（90:10）为进样溶液时，3种化合物峰形对称而尖锐。以50%甲醇为进样溶液，绿原酸的峰展宽，且与样品中杂质分离不好。最终确定0.2%甲酸-乙腈（90:10）作为进样溶液。

3.2 色谱条件的选择 对比以甲醇-水及乙腈-水为流动相的分离效果，甲醇-水作流动相时绿原酸的峰展较宽。流动相的酸度能影响黄芩苷色谱峰的拖尾因子，在乙腈-水流动相中加入0.2%甲酸，3种化合物的峰形均较理想。故试验选择乙腈-0.2%甲酸作为流动相。同时优化了梯度洗脱程序，得到了分离度以及对称因子均较好的峰形。

3.3 离子模式的选择 试验发现，黄芩苷在正离子模式下响应很高，而连翘苷在此条件下响应很低；连翘苷在负离子模式下响应值高于正离子模式。二者保留时间接近，若在短时间内切换离子监测模式，可能引起响应信号不稳定，影响测定。黄芩苷在双黄连口服液中的含量较高，采用负离子模式虽然降低其检测的灵敏度，但不影响其测定的准确度和重复性，因此采用负离子模式。

本试验建立的 UPLC-M S-M S法，简单、准确、分析周期短，适用于双黄连口服液中3种活性成分的含量测定。

[1]中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典（二部）[S].北京：中国农业出版社，2010年版.

[2]杜英峰，张兰桐，靳怡然.多波长RP-H PLC法测定双黄连口服液中黄芩苷、绿原酸和连翘苷[J].中成药，2009，31（9）：1368-1371．

[3]贺国彬，李津明，赵金凤，等.H PLC法同时测定双黄连口服液中的质控成分含量[J].黑龙江医药，2014，26（1）：972-974.

[4]罗奇志，罗佳波.双黄连粉针中化学成分的高效液相色谱-电喷雾串级质谱分析[J].中成药，2009，31（9）：1402-1404.

[5]张红伟，盛静，陈伟光，等.超高效液相色谱-质谱法同时测定双黄连胶囊中的3种有效成分[J].海峡药学，2012，24（6）：36-39.

[6]许海棠，黄丽涵，徐远金.高效液相色谱.质谱法同时测定清热解毒口服液中的5种有效成分[J].色谱，2008，26（5）：599-602.

Detection of three effective components in Shuanghuanglian Oral Liquid by UPLC-MS-MS

Liu Xuehong,Hou Ying,Qiao Ying,Li Na,Song Ping, Chen Ling,Qu Youyang,Zhang Yi duo
(Dalian Institute Veterinary Drug and Feedstuffs Control, Liaoning Dalian 116037)

A method of UPLC- MS/MS was developed to determine three effective components (Baicalin;Chlorogenic acid;Forsythin) in Shuanghuanglian Oral Liquid. BEH C18 column was used as separationcolumn. The mobile phase was 0.2% formic acid solution and acetonitrile for gradient elution. Then the processed sample was analyzed by tandem mass spectrometer with negative electrosprayionization (ESI) source,monitored under a multiple reaction monitoring (MRM) mode.The linearranges were 0.02～10 μg/mL (r=0.9991)、0.02～10 μg/mL (r=0.9998)、0.025～10 μg/mL (r=0.9996)for chlorogenic acid, baicalin and forsythin and the limit of quantification were 0.02 mg/kg、0.02 mg/kg、0.025 mg/kg, respectively. The average recorvery was 98% ～101.7% and RSD were bothless than 2.5%. The method was accurate, sensitive, rapid and suitable for the quality control ofthe three effective components in shuanghuanglian oral liquid.

Shuanghuanglian Oral Liquid; Baicalin; Chlorogenic acid; Forsythin; Ultra-HPLC-MS-MS

TQ460.72

B

1672-9692(2016)03-0013-05

2016-02-01

刘雪红（1975-），本科，副主任药师，从事兽药及兽药残留的检验工作。