宁夏地区部分蛋鸡场新城疫卵黄抗体效价的检测与分析

张东涛，孟凡伟，周学章

（宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021）

宁夏地区部分蛋鸡场新城疫卵黄抗体效价的检测与分析

张东涛，孟凡伟，周学章

（宁夏大学西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏 银川 750021）

本研究旨在检测宁夏地区部分蛋鸡场新城疫卵黄抗体效价的水平及差异，通过血凝试验检测本实验室制备的新城疫病毒抗原的效价并校正血凝单位，血凝抑制试验检测宁夏地区14个蛋鸡场140枚鸡蛋卵黄抗体的效价。试验结果显示，新城疫病毒的血凝效价为 8 log2，卵黄抗体效价平均在10 log2～13 log2。因此，宁夏地区蛋鸡场新城疫卵黄抗体效价较高，研究结果为了解宁夏地区新城疫防治的效果提供了试验数据。

宁夏；新城疫；卵黄抗体；血凝试验；血凝抑制试验

鸡新城疫（Newcastle Disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的一种急性、高度接触性传染病,被世界动物卫生组织（O IE）列为A类传染病，是危害我国养禽业的重要疫病[1-2]。自20世纪80年代以来，我国对新城疫采取了全面免疫的防控策略，但不能忽视的是，新城疫仍然是危害我国养禽业的重要疫病，在某些地区仍然持续存在，个别地区呈地方性流行，在临床上还出现了宿主范围扩大、免疫带毒现象普遍等新的流行特征[3]。

范文颖等[4]的研究表明，新城疫或禽流感疫苗二免21 d后（在有基础免疫的情况下）卵黄抗体水平与血清抗体水平接近，卵黄抗体水平直接反映了血清抗体水平的高低。在蛋禽疾病防治中，为了及时掌握禽流感、新城疫、产蛋下降综合征等疫苗的免疫效果，了解产蛋家禽抗体水平的高低，以便制定正确的免疫程序，临床上需要对免疫家禽的卵黄抗体水平进行多次监测。这在一定程度上避免了因采血测定血清抗体给家禽造成的应激反应，不致引起家禽产蛋量的下降。应用血凝抑制试验（H I试验）检测禽蛋卵黄抗体水平是最简便、经济、准确的血清学检测方法。本试验随机检测了宁夏地区14个蛋鸡场140枚鸡蛋卵黄抗体效价，为了解宁夏地区鸡新城疫的防治效果提供了试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料 待检鸡蛋分别来自宁夏银川郊区、银南地区、银北地区等的14个蛋鸡场。LasotaIV系弱毒株由宁夏大学生物制品中心保存，新城疫阳性血清购自北京华业寰宇化工有限公司，阴性血清和鸡红细胞由本试验自制。

1.2 方法

1.2.1 鸡红细胞悬液的制备 采集3只健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用pH 7.2 0.01 m ol/L的PBS液洗涤3次，每次均以1 000 r/min离心10 min，用吸管吸去上清液和白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加PBS反复洗涤3次，上述PBS配成体积分数为0.8%红细胞悬液，4℃保存，现用现配。

1.2.2 抗原制备 非免疫受精种蛋置37℃恒温孵化箱中孵化至第10 d，剔除死胚，无菌条件下注入0.5%稀释的新城疫病毒LasotaIV系弱毒株0.2 mL于尿囊腔内，蜡封。置37℃恒温孵化箱中，72 h后收获病毒。尿囊液经2 800 r/min低速离心60 min后沉淀病毒，沉淀物用pH 7.2 0.01 m ol/L PBS重悬，置-20℃保存备用，临用前解冻。

1.2.3 血凝试验（HA）检测新城疫病毒的血凝效价在微量反应板的1～12孔均加入25 μLPBS，吸取25 μL抗原加入第l孔，混匀后从第1孔吸取25 μL，病毒液加入第2孔，混匀后吸取25 μl加入第3孔，以此进行倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取25 μL弃之，每孔再加入25 μL PBS，每孔均加入25 μL体积分数为1%鸡红细胞悬液，振荡混匀后在室温（20～25℃）下静置40 min后观察结果。以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为1个凝集单位。

1.2.4 4单位抗原的校正 配制4单位抗原并进行校正，向反应板的第2孔至第6孔加生理盐水25 μ L，吸取4单位抗原25 μL分别加入第1孔、第2孔中，充分混合后吸出25 μL至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25 μL，再吸取1%红细胞悬液依次加入1～6孔，每孔25 μL，振荡1分钟后室温静置30 min后观察结果，如第1～3孔为完全凝集，第4孔红细胞为50%沉淀，第5孔为对照完全沉淀，表明所配4单位抗原准确，校正成立，4单位抗原现配现用。

1.2.5 鸡卵黄提取液的制备 将被检鸡蛋消毒，在气室端开窗，弃净卵清，只留卵黄，搅开，取2 mL卵黄，于试管加等量的PBS，混合后再按混合液的2倍量加入氯仿，振匀，见卵黄凝结成脑样为宜，室温下静止1 h后，1 500 r/min离心20 min，吸出上清液-20℃保存备用备。

1.2.6 血凝抑制（HI）试验 在96孔微量反应板上，每排第2～12孔各加入25 μL稀释液，每排第1孔和第2孔各加入25 μL卵黄抗体上清液，从第2～10孔开始进行倍比稀释，第11孔为抗原对照，第12孔为稀释液对照。另设1排1～11孔倍比稀释的阳性血清对照。然后在1～11孔各加入25 μL 4单位抗原，最后1排加入25 μL稀释液，充分震荡1 min后室温放置20～30 min，每孔加入25 μL配置好并充分混匀的0.8%红细胞悬液，充分震荡后室温放置20～30 min后，观察结果并读数。结果判定，以完全抑制4单位抗原的卵黄抗体最高稀释倍数作为H I效价[5]。

2 结果与分析

2.1 血凝试验结果 对自制新城疫病毒抗原进行血凝试验，不同时间3个批次的9份尿囊液H A血凝效价均值为8 l og2，结果如表1所示。

2.2 44单位抗原校正结果 血凝试验测得新城役病毒H A效价平均为1:28，则单位抗原为1:64，四单位抗原校正结果显示，前3孔为红细胞完全凝集，第4孔为红细胞50%凝集，第5孔为红细胞完全沉淀，说明抗原校正成功。

2.3 血凝抑制试验结果 通过血凝抑制试验对宁夏地区鸡卵黄抗体进行检测，结果显示各地区鸡卵黄体抗体效价均大于10 l og2，平均为10～13 l og2之间，结果如表2所示。

表1 各组血凝试验HA效价均值Table1 The average value of HA in each group

表2 宁夏地区部分蛋鸡场卵黄抗体HI效价平均值Table2 The average value of IgY HI titer in Some Layer Farm of Ningxia Area

3 讨论

卵黄抗体是鸡受到外界特异性抗原的刺激后，体内发生免疫应答反应，产生免疫球蛋白，并通过卵泡膜进入卵黄，并在卵黄中大量蓄积，形成卵黄抗体，也称卵黄免疫球蛋白[6]，由于卵黄抗体的累积作用，使卵黄中的抗体明显高于血清中的含量，为雏鸡提供母源保护[7]。用特异的抗原多次免疫母禽后，所产的蛋黄中针对抗原的抗体含量会明显增加，特异的、高效价的卵黄抗体可以应用生物化学技术从蛋黄中提出[8]。卵黄抗体与哺乳动物初乳中的抗体一样，都是由母体产生，通过特殊机制从血液中转运而来。曹丹的[9]研究表明新城疫卵黄抗体与血清抗体间存在很高的相关性，鸡新城疫疫苗免疫蛋鸡后不同时期血清抗体和卵黄抗体效价基本一致，升降趋势相同。类似报道都证实卵黄抗体的检测可以很好地反映血清中的抗体[10-12]。卵黄抗体的检测方法更加简易，还能避免采血时鸡群对的应激反应，节省人力和时间。因此，通过检测卵黄抗体也可以推测鸡群的免疫状况。

本试验随机收集了宁夏银川郊区、银南地区和银北地区14个蛋鸡场共140枚鸡蛋，进行了卵黄抗体的检测。试验检测结果显示，新城疫Lasota抗原的血凝效价为1:28，4四单位抗原为1:64。宁夏地区部分蛋鸡场卵黄抗体H I效价平均值在10～13 l og2之间，个别地区卵黄抗体效价达到15 l og2，最低也在9 l og2。研究报道[13-15]，如果鸡群经新城疫疫苗免疫后，其抗体滴度平均达到6 l og2以上，鸡群就可以抵御新城疫强毒的感染。但当前情况是，即使是鸡群的抗体滴度平均达到8～9 l og2，疫病仍然会发生，且发病率和致死率非常高，即使利用传统疫苗如 LaSota、Cl one-30甚至I系苗紧急免疫效果也较差，甚至无效。抗体的总体水平高于10 l og2以上,则需要对鸡群进行仔细检测,看是否有强毒感染。为此，笔者对试验中的14个蛋鸡场进行了回访，近5年上述蛋鸡场并无新城疫的发病，随机血清抗体检测平均滴度在10～12 l og2之间，这与我们的试验结果较为一致。刘华雷等[16]人的研究结果显示宁夏地区新城疫的流行率为5.83%，同源性分析表明宁夏分离株与疫苗株LaSota同源性较低,但研究证实LaSota疫苗能够抵抗基因Ⅶ型野毒株的攻击,只是免疫保护所需要的抗体阈值越来越高[17]，这可能是导致宁夏地区新城疫卵黄抗体效价较高的原因之一。本研究结果表明，宁夏地区部分蛋鸡场新城疫卵黄抗体效价较高，宁夏部分地区新城疫防治效果较好，但由于影响血凝试验及血凝抑制试验的因素多，样本量及试验条件所限，新城疫在宁夏地区的流行、发病率以及LaSota疫苗保护效率还需更多的研究。

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Analasis and Detection on Egg Yolk Antibody Titer of Newcastle Disease in Layer Farm of Ningxia Area

Zhang Dongtao;Meng Fanwei;Zhou Xuezhang
(Key Laboratory of Ministry of Education for Protection and Utilization of Special Biological Resources in theWestern China, Ning xia University, Ningxia Yinchuan 750021)

The purpose of this study is to detect and analasize the difference and level of eggyolk antibody titer of Newcastle Disease in some layers of Ningxia area. The titer of Newcastledisease virus antigen prepared in our lab was detected by blood hemagglutination assay, and hemagglutinationunits was correct. HA titer of Newcastle disease virus antigen is detected by， andegg yolk antibody titers of 140 eggs in 14 region of Ningxia is detected by hemagglutination inhibitionassay. The results that HA titer of Newcastle disease virus antigen is 8log2, titer ofyolk antibody keep higher level ranged from 10log2～13log2 averagely. Therefore，it is higher levelthat egg yolk antibody titer of Newcastle disease in Ningxia area, and this results providesexperimental data for the prevention and control of Newcastle disease in Ningxia area.

Ningxia; Newcastle Disease; Egg Yolk Antibody; Hemagglutination Assay; HemagglutinationInhibition Assay

S858.31

B

1672-9692(2016)03-0039-04

2016-01-22

张东涛(1970-)，男，副教授，硕士，研究方向为天然活性产物药理学。

周学章(1969-)，男，教授，博士，主要从事分子病毒学和细菌耐药性及生物制药等领域的研究。