RD105缺失基因检测法在结核分枝杆菌分型中的应用※

李 斌，刘 寿，杜文琪，汪海静，苏效东，文国颖，梁 军，王兆芬

(青海大学医学院公共卫生系，810001 西宁)



RD105缺失基因检测法在结核分枝杆菌分型中的应用※

李 斌，刘 寿，杜文琪，汪海静，苏效东，文国颖，梁 军，王兆芬*

(青海大学医学院公共卫生系，810001 西宁)

目的 探讨RD105缺失基因检测法在结核分枝杆菌分型中的应用。方法 133株结核分枝杆菌分别采用Spoligotyping分型法和RD105基因缺失法鉴别北京基因型。结果 133株结核分枝中114株为北京基因型，占85.7%，19株为非北京基因型，占14.3%，经RD105缺失基因检测133株结核分枝杆菌临床分离株中，115株为北京基因型，占86.4%，18株为非北京基因型，占13.6%，Spoligotyping基因分型法与RD105缺失基因检测法比较差异无统计学意义(χ2=0.333，P=0.563)，RD105缺失基因检测法的灵敏度为99.1%，特异度为89.5%，阳性预测值为98.3%，阴性预测值为94.4%。ROC曲线下面积为0.943。结论 RD105基因缺失法检测可以替代Spoligotyping基因分型法。

结核分枝杆菌 RD105 Spoligotyping ROC曲线下面积

随着分子生物学技术的不断发展，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)基因型分型技术在该病的流行病学研究中起到了重要的作用，通过对MTB的分型可以判断出该区域流型菌株的类型、病例与病例之间的关系等。MTB中有一组具有相似遗传特征的北京型基因(Beijing genotype)。之前有研究表明青海省流行菌株为北京基因型[1]。北京基因型菌株是一类源于共同祖先的后代菌株，自1995年有van Soolingen等首次报道以来，全球已发现该菌株的流行，在亚洲地区该菌株为主要流行菌株。近年来随着研究深入，研究者发现在北京基因型中RD105存在缺失区域，提出了RD105可以作为北京基因型菌株的分子标志物[2]。本研究采用基于PCR法的RD105缺失检测法和间隔区寡核苷酸分型方法(spacer oligonucleotide typing，Spoligotyping)对青海省133株结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型，探讨RD105基因缺失检测法在结核分枝杆菌基因分型中的运用。

1 材料与方法

1.1 菌株

133株结核分枝杆菌临床分离株和对照标准菌株H37Rv由青海省疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病实验室提供。

1.2 DNA

用生理盐水从L-J培养基的斜面上洗脱菌体，80 ℃孵育30 min灭活，离心(12000r/min)3 min，弃上清收集菌体，用500 μL生理盐水充分悬浮、100 ℃水浴1 h，离心(12000r/min)5 min取上清即为PCR扩增模板。-20 ℃保存备用。

1.3 主要试剂盒、仪器

2×Taq Master Mix、0.5×TBE、DNA MarkerⅡ(北京天根生物公司)，凝胶成像仪(Bio-RAD，USA)。

1.4 Spoligotyping基因分型法与RD105缺失基因检测法

1.4.1 Spoligotyping基因分型法

DR区引物设计和反应条件及43个寡核苷酸探针设计参照参考文献[3]，将Spoligotyping结果进行数字转化，并通过SpolDB4.0数据库进行比对分析确定菌株的类型。

1.4.2 RD105缺失基因检测法

引物设计和反应条件参照文献[4]，RD105F：CAAGGTACGGCGGCTGGGGATTC；RD105R：GCGGCGGGGTTAAACAGGGTGAT。PCR反应条件：预变性94 ℃ 1 min；变性94 ℃ 30 s；退火68 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 285 s，26个循环；终延伸72 ℃ 10 min。取10 μLPCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，用DNA Marker确定其分子相对量，以标准株H37Rv作为对照。目的片段为408 bp，出现此片段为非北京基因型，未出现此片段为北京基因型。

1.5 数据分析方法

所得资料采用Stata10.0软件进行分析，两种方法比较采用配对χ2检验，分别计算灵敏度(sensitivity)、特异度(specificity)、预测值(predictive value)、ROC曲线下面积(the area under the ROC curve)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Spoligotyping基因分型法结果

用Spoligotyping基因分型法，通过SpolDB4.0数据库比对分析。H37Rv杂交结果为20、21，33～36位点阴性，其余位点均为阳性。1～34位点阴性，35～43阳性者为典型北京家族基因型(Beijing genotype)，35～43位点间或缺失，但阳性位点至少有4个为北京基因型(Beijing-like)或非典型北京家族基因型。以上两种基因型统称为北京家族基因型。133株结核分枝中114株为北京基因型，占85.7%，19株为非北京基因型，占14.3%。结果见图1。

图1 部分Spoligotyping基因分型结果

Figure 1 The partial results of genotypic identification with Spoligotyping test

2.2 RD105缺失基因检测法结果

用RD105缺失基因法，检测133株结核分枝杆菌临床分离株，115株为北京基因型，占86.4%，18株为非北京基因型，占13.6%。结果见图2。

图2 RD105检测结果

Figure 2 The result of RD105 deletion test

2.3 RD105缺失基因检测北京型菌株的评价效果

Spoligotyping基因分型法是检测北京型基因的金标准[5]，故采用此方法来评价RD105缺失基因检测法。两种方法比较差异无统计学意义(χ2=0.333，P=0.563)。RD105缺失基因检测法的灵敏度为99.1%，特异度为89.5%，阳性预测值为98.3%，阴性预测值为94.4%。ROC曲线下面积为0.943。结果见表1。

表1 Evaluation of Beijing type strain

3 讨论

传统的流行病学方法只能从疾病的“三间分布”了解情况，不能很好地揭示结核病的传播规律。分子生物学DNA指纹技术，与传统的传染病流行病学研究相结合，可以确定传染病的起源、传播、分布、消长和流行规律[6]。传统的分型技术包括药敏分型、生物化学多样性等方法，但这些方法存在诸多缺陷。随着研究者们在结核分子流行病研究技术上的不断深入，分子分型技术现今成为结核病流行病学的主要研究方法之一。现代分子生物学技术以其简便、快捷、敏感性好和特异性高而广泛应用。其中IS6110-限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，IS6110-RFLP)、多位点可变数量串联重复序列分析(multiple loci VNTR analysis，MLVA)及Spoligotyping分析等已成为结核菌株分型的重要方法。

IS6110-RFLP是国际一致公认的DNA分型方法的“金标准”，但IS6110-RFLP分型方法需要提取结核菌大量的DNA，获得结果的时间长，且结果的重复性和比较性较差，对于IS6110拷贝小于5个或无拷贝结核菌株分辨能力差，需要一些特殊的软件分析结果，影响了该方法的推广。

可变数目串联重复序列(variable-number tandem repeat，VNTR)存在高度多态性，DNA片段高度重复。因此将多个VNTR位点联合起来可提高鉴别能力，即MLVA，其基因分型方法的辨识能力几乎等同于以IS6110为基础的基因分型，但该技术简便快速，可操作性强。不但弥补了IS6110-RFLP基因分型技术在低拷贝菌株分型中的不足，而且它一般不需用高度纯化的DNA，可直接使用结核分枝杆菌的培养物。且结果是数字化的，易于建立数据库，便于与其他菌株间的比较。但与Spoligotyping分型方法比较显得工作过于繁重。

Spoligotyping基本原理是基于直接重复区(direct repeat，DR)的多态性，DR区只出现于结核分枝杆菌复合群中，由若干个保守的长为36 bp的直接重复序列组成，并被间隔区分开，每个间隔区序列长为35～41 bp，不同的MTB菌株在43个间隔区存在不同的序列，由此可对MTB进行鉴别。该方法是一种独特的以PCR为基础的分子分型方法，其操作简便、结果易于数字处理、可重复性高、分型效果稳定并且具有较丰富的多态性，在世界范围内得到广泛的应用。

而近些年通过比较基因组学的一些方法发现结核菌的基因上存在片段缺失，这些容易发生缺失的片段称为Large sequence polymorphism或Regions of Difference，简称LSP或RD。有学者以RD为分类靶标研究全球范围收集的结核分枝杆菌，发现全球结核分枝杆菌的流行具有明显地域性，并据此将结核分枝杆菌分为6个具有进化关系的分化支：印度-大洋洲系(Indo-Oceanic)，东亚系(East Asian)、东非-印度系(East African-Indian)、欧美系(Euro-American)、西非-1系(West African 1)和西非-2系(West African 2)[7]。该方法基于PCR实验技术，且单次的实验方法在技术、人力、物力和财力等方面要远远低于Spoligotyping分型方法。

RD105基因缺失存在于北京基因型，在非北京基因型非常罕见[2]。RD105基因缺失检测方法基于PCR技术，实验方法简便，易操作，对于结果不需要特殊的软件进行分析，易于实施。本研究采用该技术对于133株结核分枝杆菌临床分离株进行分型，结果115株(86.4%)为北京基因型，18株(13.6%)为非北京基因型。而采用Spoligotyping分型方法进行菌株分型，133株结核分枝中114株为北京基因型，占85.7%，19株为非北京基因型，占14.3%。

王娟[8]等人通过比较两种方法得到二者的Kappa值为0.8，提示RD105不能完全替代Spoligotyping。但是本研究通过Spoligotyping基因分型法评价RD105基因缺失法检测，灵敏度为99.1%，特异度为89.5%，阳性预测值为98.3%，阴性预测值为94.4%。ROC曲线下面积为0.943，两种检测方法比较差异没有统计学意义(χ2=0.333，P=0.563)，说明RD105基因缺失法检测可以替代Spoligotyping基因分型。这与刘敬华[9]等人研究结果一致，RD105与Spoligotyping检测结果符合率达100.0%，Kappa值为1.0。

诊断实验是一种评价诊断方法准确性和重要性的研究方法。其目的是通过“金标准”去评价待检测方法的准确性。在诊断实验中灵敏度和特异度能很好反映诊断实验的准确性，这两个指标越接近100.0%，显示准确性越高。而预测值同样也是评价诊断实验准确性的指标，该指标受到灵敏度和特异度的影响，会随着灵敏度和特异度的升高或降低而发生改变。ROC曲线综合反映诊断实验对待评价实验方法诊断价值。并且ROC曲线兼顾了灵敏度和特异度，通过对ROC曲线下的面积大小来判断诊断实验的优良性。ROC曲线下面积接近1，诊断实验效果越好。反之，接近0.5，诊断效果越差。而本研究所得结果显示，灵敏度和特异度均接近100.0%，预测值也在90.0%以上，ROC曲线下面积也接近1，说明RD105基因缺失检测法对MTB进行北京基因型和非北京基因型鉴别效果良好，存在误差较小。

综上所述，RD105基因缺失法与Spoligotyping基因分型法比较存在简便易行，读取结果方便，不需要借助其他软件进行分析的优点，比Spoligotyping基因分型法更加可行。因此，RD105基因缺失法可以替代Spoligotyping基因分型法。

[1]李斌，刘海灿，王兆芬，等.青海省结核分枝杆菌临床分离株可变数目串联重复序列基因多态性研究[J].中华流行病学杂志，2015，36(10)：1158-1161.

[2]刘桂艳，张炜煜，王博，等.RD105基因缺失法鉴定95株结核分枝杆菌北京基因型及其耐药相关性分析[J].中国卫生工程学.2012，11(5)：363-365.

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[4]李斌，文飞，刘寿，等.RD105缺失基因检测法用于青海省北京/W系结核分枝杆菌鉴定[J].广州医药，2015，46(5)：11-14.

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[8]Wang J，Liu Y，Zhang CL，et al.Genotypes and characteristics of clustering and drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis isolates collected in Heilongjiang Province，China[J].Journal of clinical microbiology，2011，49(4)：1354-1362.

[9]Liu JH，Liu Y，Zhang CL，et al.Genotypes and characteristics of clustering and drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis isolates collected in Heilongjiang Province，China[J].Journal of clinical microbiology，2013，49(3)：1356-1362.

Identification of the Mycobacterium tuberculosis detected by RD105 deletion test※

Li Bin，Liu Shou，Du Wenqi，Wang Haijing，SuXiaodong，Wen Guoying，Liang Jun，Wang Zhaofeng※

(Dept.Of Public Health，Qinghai University Medical College，Xining，Qinghai 810001)

Objective To identify theMycobacteriumtuberculosisdetected by RD105 deletion test.Methods 133 strains of M.tuberculosiswere identified with Spoligotyping testand RD105 deletion test respectively to classify the Beijing genotype.Results Of the 133 clinical isolates ofM.Tuberculosis，114 strains(85.7%)were belonged to the Beijing genotype，and 19strains(14.3%)were belonged to the non-Beijing genotype identified by the Spoligotyping test.While 115 strains(86.4%)were belonged to the Beijing genotype and 18strains(13.6%)were belonged to the non-Beijing genotype identified by the RD105 deletion test.There were no significant differences between the two kinds of test(χ2=0.333，P=0.563).The sensitivity，specificity，positive predictive value，negative predictive value and ROC curve area of the RD105 deletion test were 99.1%，89.5%，98.3%，94.4%，0.943，respectively.Conclusions RD105 deletion testcan replace the Spoligotyping test.

MycobacteriumtuberculosisRD105 deletion test Spoligotyping test the area under the ROC curve

※：国家自然科学基金(81160356)；青海省科技厅自然科学基金(2014-ZJ-910)；青海大学医学院中青年科研基金(2013-KY-02)；*：通讯作者，E-mail：kristy@126.com 李 斌(1983～)男，蒙古族，河北籍，讲师，硕士

R735.2

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.007

2015-12-12