血红素加氧酶-1在糖尿病心肌病中的保护作用※

司立宁，刘慧琴，王晓丽，王 财，庄正燕，甘桂芬

(青海大学附属医院，青海 西宁 810001)



血红素加氧酶-1在糖尿病心肌病中的保护作用※

司立宁，刘慧琴，王晓丽，王 财，庄正燕，甘桂芬*

(青海大学附属医院，青海 西宁 810001)

目的 观察血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)对链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的保护作用并探讨其相关分子机制。方法 对出生8 w的雄性HO-1转基因小鼠和同笼阴性小鼠连续5次腹腔注射STZ(50mg/kg)，以血糖≥16.7 mmol/L作为糖尿病模型入选标准，常规饲养8 w，期间每周检测小鼠血糖、饮水量、进食量、尿量和体重，小鼠取材前利用超声心动图检测小鼠左室心脏功能。断颈处死小鼠后取左室心肌并进行电镜和病理组织学检查；用qRT-PCR法检测心肌ANP、BNP mRNA表达情况。并对相关数据作统计学分析。结果 超声心动图检查发现，与对照组小鼠相比糖尿病组小鼠均存在心脏功能障碍，过表达HO-1的糖尿病小鼠左室心脏功能明显好于糖尿病小鼠；HE染色和透射电镜结果显示糖尿病小鼠心肌结构紊乱，线粒体损伤明显；过表达HO-1糖尿病小鼠心肌结构和线粒体结构紊乱情况改善。相对于对照组小鼠，糖尿病小鼠心肌中ANP和BNP mRNA表达升高，过表达HO-1糖尿病小鼠心肌中ANP和BNP mRNA表达降低。结论 HO-1可改善由糖尿病引起的心脏功能障碍和心肌结构损伤。

糖尿病心肌病 血红素加氧酶-1 保护作用

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)与糖尿病患者心血管疾病的高发生率和高病死率密切相关[1]。血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)作为一种公认的心肌保护因子，可通过其产物的抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用发挥对心脏的保护功能[2]。但有关HO-1在糖尿病心肌病中的作用认识存在相互矛盾的现象。本研究利用过表达HO-1的转基因小鼠，通过腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导糖尿病心肌病模型，观察HO-1对STZ诱导的糖尿病心肌病的保护作用并探讨其相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器选择

雄性SPF级Tg-HO-1转基因小鼠和同笼阴性小鼠各30只，购自STZ购自Sigma公司。Trizol试剂、逆转录试剂盒、Real-time PCR试剂盒均购自Invitrogen公司；7500型号Real-time PCR仪购自ABI公司；血糖仪和血糖试纸条购自Roche公司；IE33型号心脏超声仪购自PHILIPS公司。

1.2 实验分组与动物模型制作

将动物按体重随机分为4组，对照组(Wt/Con，n=15)、过表达HO-1对照组(HO-1/Con，n=15)、糖尿病组(Wt/DM，n=15)、过表达HO-1糖尿病组(HO-1/DM，n=15)。

STZ溶解在pH为4.5的枸橼酸盐缓冲液中，使用前临时配制，连续5次腹腔注射STZ(50mg/kg)诱导糖尿病模型，对照组腹腔注射柠檬酸盐缓冲液，72 h后取尾静脉血测随机血糖，以血糖≥16.7 mmol/L作为糖尿病模型入选标准。所有动物自由饮水，喂养8 w后进行实验。实验过程中出现少量动物死亡。

1.3 血糖、体重、饮水量、进食量和尿量测定

各组小鼠每周测定随机尾静脉血糖1次；每周测定小鼠体重1次；每周利用代谢笼测定各组小鼠饮水量、进水量和尿量1次。

1.4 心功能评价

各实验组小鼠以2%异氟烷吸入麻醉，仰卧位固定于37 ℃恒温加热板上，左胸前区脱毛，采用14 MHz的高频心脏超声探头置于小鼠左侧胸前，2D超声示左室短轴切面，在乳头肌水平应用M模式超声记录左心室情况，取3个心动周期的平均值记录数据。超声学检测指标：左室舒张末期容积(left ventricular end diastolic volum，LVEDV)，左室收缩末期容积(left ventricular end systolic volum，LVESV)，射血分数(left ventricular ejection fraetion，LVEF)。

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1.5 心肌形态学观察

透射电镜检测：快速切取大小为0.5～1.0 mm3的样品，1 min内把组织块浸入2.5%戊二醛溶液固定。送检兰州大学电镜中心。HE染色：沿小鼠心脏左心室纵切，取适量心肌组织，加10倍量4%多聚甲醛固定，脱水后用石蜡包埋，切片(厚度4μm)，行常规HE染色，镜下观察：细胞核深蓝色，胞浆及纤维组织呈深浅不等的红色。

1.6 心肌内ANP和BNP mRAN水平检测

采用Trizol试剂提取各组小鼠心肌组织总RNA。取总RNA 2 μg，逆转录合成第一链cDNA。以第一链cDNA为模板，PCR扩增ANP和BNP，内对照为GAPDH。引物设计如下：

ANP sense，5′-CACGCCAGCATGGGCTCCTT-3′；

ANP antisense，5′-CTAAGTGCCGCCCCCGCTTC-3′；

BNP sense，5′-GACGGGCTGAGGTTGTTTTA-3′；

BNP antisense，5′-ACTGTGGCAAGTTTGTGCTG-3′；

GAPDH sense，5′-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3′；

GAPDH antisense，5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠血糖、进食量、饮水量、尿量、体重及心重/体重的变化(表1)

糖尿病小鼠建模成功后8 w，每周检测小鼠的血糖、进食量、饮水量、尿量和体重，结果显示与Wt/Con组相比，Wt/DM组小鼠血糖、进食量、饮水量和尿量均明显升高(P<0.01)，体重明显降低(P<0.01)，糖尿病小鼠出现“三多一少”的表型，与临床糖尿病患者体征相似；与Wt/Con组相比，Wt/DM组小鼠心脏重量明显减少(P<0.01)，心重/体重比值明显升高(P<0.01)。与Wt/DM组相比。HO-1/DM组小鼠血糖(P<0.05)、尿量(P<0.01)和心重/体重比值(P<0.01)明显降低，饮食量(P<0.05)和体重(P<0.01)明显升高，饮水量和心脏重量无显著差异。

Table 1 Basic parameters of mice in each ±s)

与Wt/Con组比较，#P<0.05，##：P<0.01；与Wt /DM 组比较，*P<0.05，**P<0.01.

2.2 各组小鼠左心室功能变化(表2)

临床研究发现，长期糖尿病患者会伴随左心室舒张和收缩功能障碍。腹腔注射STZ 8 w后，利用多普勒超声仪检测小鼠左心室功能。表2结果显示与Wt/Con组相比，Wt/DM组小鼠LVESV(P<0.01)和LVEDV升高(P<0.05)，LVEF降低(P<0.01)。与Wt/DM组相比，HO-1/DM组小鼠LVESV降低(P<0.01)，LVEF升高(P<0.01)，但LVEDV差异不显著。由此可见，过表达HO-1可以保护糖尿病小鼠心脏功能障碍。

Table 2 Left Ventricular Function of the mice in each ±s)

与Wt/Con组比较，#P<0.05，##：P<0.01；与Wt /DM 组比较，*P<0.05.

2.3 各组小鼠左心室HE染色及电镜变化(图1)

糖尿病小鼠左室心肌HE染色：与Wt/Con组或HO-1/Con组相比，Wt/DM组小鼠左室心肌HE染色发现明显的肌纤维紊乱，并有炎症细胞浸润；与Wt/DM组相比，HO-1/DM组小鼠左室心肌肌纤维排列较整齐。电镜：Wt/DM组小鼠肌纤维溶解、断裂，并且线粒体出现肿胀，但HO-1/DM组小鼠左室心肌肌纤维排列较整齐，线粒体结构基本正常。该结果提示过表达HO-1可能能改善糖尿病引起的心肌结构损伤。

a、b、c、d：将小鼠左心室肌组织的石蜡切片进行HE染色，观察心肌的形态学(20μm)；e、f、g、h：将小鼠左心室肌组织行透射电镜检测，观察心肌超微结构(5μm)

图1 各组小鼠心肌结构图

Figure 1 Cardiac Morphology and electron micrographs of mice in each group

2.4 各组小鼠心肌中ANP和BNP的表达(表3)

ANP和BNP是反映心脏功能的两个重要指标。Wt/Con组和HO-1/Con组之间小鼠心肌ANP和BNP mRNA 表达无显著差异；与Wt/Con组相比，Wt/DM组小鼠心肌ANP和BNP mRNA表达升高(P<0.01)；过表达HO-1后这种升高明显被抑制(P<0.01)。该结果与超声和形态学结果一致，进一步验证了HO-1在糖尿病心肌病中发挥着保护心脏功能的作用。

Table 3 The Cardiac ANP and BNP mRNA expression in each group of ±s)

与Wt/Con组比较，#P<0.01；与Wt /DM组比较，*P<0.01.

3 讨论

本研究通过利用过表达HO-1的转基因小鼠证实：HO-1在STZ诱导的糖尿病心肌病小鼠模型中具有保护左室心肌结构和心脏功能的作用。

临床上将排除冠状动脉疾病或高血压病之外的由糖尿病引起的左室功能障碍和结构异常的疾病称为糖尿病心肌病。临床证据显示糖尿病心肌病患者心脏功能障碍早期主要表现为以舒张功能降低为主的心功能减弱，心脏多普勒超声技术检查糖尿病心肌病早期患者时发现，LVEDV升高，同时早期左室充盈下降，患者舒张期延迟；晚期的糖尿病心肌病患者心脏超声结果显示，LVESV升高，同时LVEF降低[3]。本研究采用连续5次腹腔注射STZ(50mg/kg)诱导造模，在注射后8 w心脏功能明显受损，小鼠心脏超声结果显示，LVESV、LVEDV均升高，LVEF降低，并且心肌中ANP和BNP mRNA表达明显升高，发现心肌结构紊乱和线粒体损伤。

HO-1在很多心血管疾病中发挥重要的保护作用。DiFilippo对STZ诱导的大鼠的心肌梗死面积与HO-1的表达进行相关研究，发现使用HO-1的拮抗剂抑制HO-1表达造成梗死面积的进一步增加[4]。有研究表明，糖尿病心肌病大鼠模型中氧化应激可诱导HO-1表达增加，认为HO-1对慢性高血糖诱发的氧化性损伤具有保护作用。Turkseven等也发现糖尿病大鼠中HO-1表达增加，并且伴随超氧化物歧化酶和过氧化氢酶表达增加，以此有效清除细胞基质中的超氧阴离子[5]。刘璐等研究发现，上调HO-1可抑制氧化应激反应，恢复eNOS/iNOS平衡，提高内皮功能和胰岛素敏感性，达到改善心肌功能和冠脉灌注效果的目的[6]。但是，Hana研究发现高血糖可通过诱导HO-1表达增加和活性提高，增加心肌中的氧化应激损伤[7]。本研究发现过表达HO-1可以降低LVESV和升高LVEF，降低心肌中ANP和BNP mRNA的表达，改善糖尿病心肌病小鼠左室心脏功能，并且过表达HO-1可保护心肌结构紊乱和线粒体损伤。因此，我们设想HO-1在糖尿病心肌病中可能具有”双刃剑”作用，该作用可能与其活性阈值相关。

HO-1是体内一种有效的抗氧化应激的酶系统，是防治糖尿病心肌病发生发展的重要心脏保护因子。但本研究仍需进一步阐明HO-1保护糖尿病心肌病的具体机制。

[1]Hamby RI，Zoneraich S，Sherman L.Diabetic cardiomyopathy[J].JAMA，1974，229：1749-1754.

[2]Wu ML，Ho YC，Yet SF.A central role of heme oxygenase-1 in cardiovascular protection[J].Antioxid Redox Signal，2011，15(7)：1835-1846.

[3]Galderisi M.Diastolic dysfunction and diabetic cardiomyopathy：evaluation by Doppler echocardiography[J].J Am CollCardiol，2006，48：1548-1551.

[4]DiFilippo C，Marfella R，Cuzzocrea S，et al.Hyprglycemia in streptozotocin-induced diabetic rat increases in farctsize associated with low levels of myocardial HO-1 during ischemia/reperfusion[J].Diabetes，2005，54(3)：803-810.

[5]TurksevenS，KrugerA，MingoneCJ，et al.Theantioxdant mechanism of heme oxygenase-1 involves an increase in superoxide dismutase and catalase in experimental diabetes[J].Am J Physiol Heart CircPhysiol，2005，289(2)：701-707.

[6]刘璐，曹剑，李健，等.上调血红素加氧合酶对糖尿病大鼠心功能的影响及可能机制[J].解放军医学院学报，2014，35(12)：1237-1240.

[7]Farhangkhoee H，Khan ZA，Mukherjee S，et al.Heme oxygenase in diabetes-induced oxidative stress in the heart[J].J Mol Cell Cardiol，2003，35：1439-1448.

The Protective Effect of Heme Oxygenase-1 in the Diabetic Cardiomyopathy※

Si lining，Liu Huiqin，Wang Xiaoli，Wang Cai，Zhuang Zhengyan，Gan Guifen*

(Affiliated Hospital of Qinghai University，Qinghai Xining 810000)

Objective To determine the molecular mechanism of the Heme Oxygenase-1(HO-1)plays a major protective role in streptozotocin(STZ)induced diabetic cardiomyopathy(DCM).Methods The diabetic mouse model was induced by consecutive peritoneal injections of STZ(50mg/kg).Blood glucose levels≥16.7mmol/L were defined as diabetes and routinely feed for 8 w.In the whole experiment process，the blood glucose，water intake，food intake，urine volume and body weight of the mice were monitored.The left ventricular function of the mice was detected by echocardiography.The mice were sacrificed by cervical dislocation and then the left ventricular myocardial was removed.The left ventricular myocardial was observed by electron microscopy and histopathological detection.The expression of ANP and BNP mRNA in the myocardium was detected by qRT-PCR.The Data were analyzed by statistics.Results Compared with the control group，there was a left ventricular cardiac dysfunction in the diabetic mice and overexpression of HO-1 was appeared in the control group than those in diabetic mice.Overexpression of HO-1 was alleviated myocardial structure changes.Myocardial ANP and BNP mRNA were decreased in HO-1 overexpressed mice compared with diabetic mice.Conclusion HO-1 can improve cardiac dysfunction and myocardial structural damage in DCM.

Diabetic cardiomyopathy Heme Oxygenase-1 Protective Effect

※：国家自然科学基金项目(项目编号：81060162)；国家自然科学基金项目(项目编号：81460284)；国家自然科学基金项目(项目编号：81460051)；青海省自然科学基金青年项目(项目编号：2014-ZJ-944Q)；青海省科技厅应用基础研究项目(项目编号：2015-ZJ-744)*：通讯作者，主任医师，xzhd1991@163.com 司立宁(1980～)，女，汉族，湖北籍，主治医师

R587.2

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.006

2016-01-04