HPLC法测定睡莲花中烟花苷和紫云英苷的含量

买吾拉江·阿不都热衣木 李倩 王亮 徐芳 吉腾飞 赵军

【摘 要】 目的：建立睡莲花中烟花苷和紫云英苷的含量测定方法，为该药材质量标准制定提供依据。方法：采用HPLC法测定，色谱柱：Phenomenex GeminiC18（250mm×46mm，5μm）；流动相：乙腈-02%磷酸水溶液梯度洗脱；流速：10mL/min；柱温：30℃；检测波长：350nm。结果：烟花苷和紫云英苷的线性范围分别为256～7680 μg（r2=9999）、20～600 μg（r2=9999）；平均回收率（n=6）分别为10006%、9907%。结论：该方法操作简单、重复性好，可用于控制维吾尔药睡莲花的质量。

【关键词】 雪白睡莲；烟花苷；紫云英苷；高效液相色谱

【中图分类号】R2841 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）20-0020-03

睡莲花为睡莲属多年生水生草本植物雪白睡莲（Nymphaea candida Presl）的干燥花蕾，主要分布于我国新疆的伊犁、阿勒泰和博湖地区[1]。睡莲花为维吾尔医习用药材，具有清热解毒、镇静安神的功效，临床主要用于热症引起的头痛、热感咳嗽及小儿急、慢惊风等病症的治疗，收载于《中华人民共和国药品标准维吾尔药分册》中[2]。药理证实，睡莲花具有抗氧化、抗炎、降血糖等多种生物活性[3-6]。黄酮类成分烟花苷和紫云英苷是睡莲花主要的特征性成分[7]。为了更好的控制睡莲花药材的质量，本研究通过高效液相色谱建立了睡莲花中烟花苷和紫云英苷的含量测定方法。

1 仪器与材料

11 仪器 SPD-10Avp高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AS系列超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。

12 材料 对照品烟花苷（纯度9895%，自制）；紫云英苷（批号：MUST-15080515，成都曼思特生物科技有限公司）。雪白真纯净水（新疆乌鲁木齐雪白真纯净水有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸、乙醇等有机溶剂均为分析纯。睡莲花药材购自新疆维吾尔药业有限公司，由新疆药物研究所何江副研究员鉴定为雪白睡莲NCandida Presl的干燥花蕾。

2 方法与结果

21 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的烟花苷和紫云英苷对照品适量，加甲醇制成含烟花苷0256mg/mL和紫云英苷0200mg/mL的对照品溶液。

22 供试品溶液的制备 取睡莲花适量，粉碎，过50目筛。精密称取粉末01g置25mL量瓶中，加入25mL甲醇，超声处理 30min后用045μm 的微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品。

23 色谱条件 色谱柱：Phenomenex GeminiC18（250mm×46mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-02%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序（0～25min，18%A～20%A）；柱温：30℃；流速：10mL/min；检测波长：350nm；进样量：10μL。在上述色谱条件下对照品及样品色谱图见图 1。

24 方法学考察

241 线性关系考察 分别精密移取烟花苷、紫云英苷对照品溶液01、02、05、10、20 、30mL于10mL量瓶中，用甲醇定容。按上述色谱条件分别测定峰面积，以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）绘制标准曲线，得回归方程分别为Y=159986039797X-5178301，r2 =09999，线性范围为 256～7680μg；Y =206668655207X-42277851，r2 =09999，线性范围为20～600μgL。

242 精密度试验 取混合对照品溶液连续进样6次，测定峰面积，计算烟花苷、紫云英苷峰面积的RSD分别为091%、141%，表明该方法精密度良好。

243 稳定性试验 睡莲花粉末01 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备后，分别于0、1、2、4、8、24h 测定，烟花苷、紫云英苷峰面积的RSD分别为132%、162%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

244 重复性试验 取睡莲花粉末，按“22”项制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，平行操作6份，测得烟花苷、紫云英苷的平均含量分别为41554mg/g、14396mg/g，RSD分别为151%、193%。

245 加样回收率试验 精密称取已测定的睡莲花粉末6份，每份约005g，分别精密加入0256mg/mL烟花苷对照品溶液15mL、0200mg/mL紫云英苷对照品溶液097mL，加入甲醇20mL，超声处理30min后定容至25mL，过045μm 的微孔滤膜，按上述色谱条件测定，以外标法计算回收率。结果烟花苷、紫云英苷平均回收率分别为10006%、9907%，RSD分别为093%、154%。

25 样品含量测定 精密称取3份睡莲花粉末各01g，按“22”项所述方法制备，精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪进行测定，计算烟花苷和紫云英苷的含量。结果显示睡莲花药材中烟花苷的含量为（531±003）mg/g，紫云英苷含量为（160±001）mg/g。

3 讨论

本实验通过HPLC法建立了同时测定睡莲花中烟花苷和紫云英苷的方法。在测定过程中，考察了不同浓度的甲醇对两种成分的提取效率，结果发现高浓度的甲醇提取效率最高，因此选择甲醇作为提供溶剂。经方法学考察，证明该方法简便易行、重复性好，可为睡莲花药材质量控制方法的建立提供依据。

参考文献

[1] 中华人民共和国卫生部中国药典委员会.卫生部颁标准维吾尔药分册[M]. 乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社， 1999：41.

[2]刘勇民. 维吾尔药志（下）[M]. 乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社， 1999：541.

[3]Zhao J， Liu T， Ma L， et al. Antioxidant and preventive effects of extract from Nymphaea candida flower on in vitro immunological liver injury of rat primary hepatocyte cultures [J]. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine，2009，（10）：1093.

[4]Hsu CL， Fang SC， Yen GC. Anti-inflammatory effects of phenolic compounds isolated from the flowers of Nymphaea mexicana Zucc [J]. Food Function， 2013， 4（8）：1216-1222.

[5]Rajagopal K， Sasikala K， Ragavan B. Hypoglycemic and antihyperglycemic activity of Nymphaea stellata flowers in normal and alloxan diabetic rats [J]. Pharmceutical Biology，2008， 46（3）： 654-659.

[6]赵军， 徐芳， 吉腾飞，等. 睡莲属植物化学成分及生物活性研究进展[J].天然产物研究与开发，2014，26（1）： 141-147.

[7]赵军， 闫明， 贺金华，等. 维药睡莲花中的黄酮醇苷类成分分析[J].中国现代应用药学杂志， 2018，25（2）： 115-117.

（编辑：程鹏飞）