明目蒺藜丸中黄酮类物质的HPLC指纹图谱研究

韩达斌 韩晓萍

青海省食品药品监督管理局食品药品审评中心(西宁810007)



明目蒺藜丸中黄酮类物质的HPLC指纹图谱研究

韩达斌 韩晓萍△

青海省食品药品监督管理局食品药品审评中心(西宁810007)

目的 ：建立明目蒺藜丸中总黄酮类物质指纹图谱测定的高效液相色谱(HPLC)方法，并对不同企业样品进行相似度分析。方法:样品处理中采用聚酰胺柱色谱对明目蒺藜丸中的黄酮类成分进行复集和纯化，HPLC条件为Waters ATLANTIS-C18(4.6 mm×250mm,5μm)色谱柱，以乙腈为流动相A，以含有0.2%三乙胺的0.2%乙酸溶液为流动相B，梯度洗脱，检测波长210nm；流速1.0ml/min；柱温25℃；进样量10μL。结果：指纹图谱中标示了14个共有峰，其峰面积之和大于总峰面积的90%，全部样品的总黄酮指纹图谱相似度在0.699～0.955范围内。结论：建立的方法能较好反映明目蒺藜丸中黄酮类物质的存在情况。

明目蒺藜方最早收载于《饲鹤亭集方》、《同寿录》卷二、《眼科临症笔记》，所载组药味较少，后在此基础上衍生出了由23味药材组成的明目蒺藜方，见于《北京市中药成方选集》, 用于上焦火盛引起的暴发火眼，云蒙障翳、羞明多眵、眼边赤烂，红肿痛痒，迎风流泪。方中含有大量的含黄酮类物质的药材，如菊花、黄芩、蒺藜、密蒙花等，它具有清热散风，明目退翳之功效。为了更好地考察此组药味中黄酮类物质在明目蒺藜丸中的整体存在情况，比较不同生产企业之间样品的差异性，较为全面地反映中药复方的整体协同作用，全面确保其质量安全有效[1-2]。本研究对明目蒺藜丸进行了黄酮类组分的指纹图谱[3]研究，结果表明，该方法稳定精密、重复性好、操作简便、谱图信息丰富，能全面地反映黄酮类物质在明目蒺藜丸中的存在情况及不同企业用品之间的相似度差异。

1 材 料

Agilent 1260高效液相色谱仪，DAD检测器，色谱柱Waters ATLANTIS (4.6 mm×250mm,5μm)；HH-6温控水浴锅，超声清洗器，数据分析软件为国家药典委员会2012年版中药色谱指纹图谱相似度评价系统；菊花对照药材(批号121384-201103)、黄芩对照药材(批号120955-200607)、密蒙花对照药材(批号121509-200501)、甘草等对照药材(批号120904-2010015)、盐酸小檗碱对照品(批号110713-200911)、汉黄芩素对照品(批号111514-200403)、橙皮苷对照品(批号110721-200512)、黄芩苷对照品(批号110715-200111)、蒙花苷对照品(批号111528-200606)，均购自中国食品药品检定研究院；处方中23味药材均购自青海省西宁市八一路药材市场(经青海省食品药品检验所中药室王慧春主任药师检定)；乙腈为色谱纯，95%乙醇、无水乙醇、36%乙酸、三乙胺为分析纯。

明目蒺藜丸样品(2013年国家评价性抽验品种，12个企业)共计26批，来源及编号详见表1。

表1 明目蒺藜丸取样汇总

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters ATLANTIS十八烷基硅烷键合硅胶柱(0.46cm×2.50cm,5μm)；以乙腈为流动相A，以含有0.2%三乙胺的0.2%乙酸溶液为流动相B，按表2进行梯度洗脱；流速1.0ml/min；检测波长为紫外210nm；色谱柱温度35℃；进样量为10μL。以汉黄芩素峰计算理论板数不低于3000[4]。

表2 HPLC洗脱梯度

2.2 参照物的制备 精密称定，置于100ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，混匀，每1ml分别含50μg的混合溶液。

2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25ml，密塞，称定重量，加热回流1h，放冷，用70%乙醇补足减轻的重量，摇匀，离心，精密吸取上清液20ml置于蒸发皿中，蒸干，残渣加水10ml使溶解，置于聚酰胺柱(30～60目，1.25g，内径为1.5cm，柱长为15cm，干法装柱)上，用水15ml洗脱，水液弃去，继用95%乙醇20ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙醇溶解，转移并定容至10ml量瓶中，滤过，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验：精密称取明目蒺藜丸，按“2.3项”制备供试品溶液，连续进样5次，在“2.1项”的条件下进行分析，比较各共有指纹的保留时间和峰面积，结果表明各批样品中共有峰的保留时间和峰面积基本稳定，其RSD<2%，符合指纹图谱的检测要求[5]。

2.4.2 稳定性试验：取同一明目蒺藜丸的供试品溶液，在“2.1项”的色条件下分别在0、4、8、12、16、20、24h进样分析，比较各共有指纹峰的保留时间和峰面积，结果各共有峰的保留时间和峰面积基本一致，RSD<2%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.4.3 重现性试验：精密称取同一批明目蒺藜丸样品5份，分别按“2.3项”制备成供试品溶液，在“2.1项”的色谱条件下进行测定，比较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD<2%，符合指纹图谱的检测要求[6]。

2.5 共有峰的确认 采用上述拟定的方法对25批样品进行HPLC指纹图谱测定，并用盐酸小檗碱和汉黄芩素进行峰位确认，同时用菊花、甘草、黄芩、旋复花、黄连等几味对照药材对HPLC图谱中的峰进行药材归属和确认，确定出黄酮类成分的指纹图谱中较为明显的14个共有峰，共有峰面积之和大于总峰面积的90%，其中峰9、峰11分别为盐酸小檗碱和汉黄芩素的峰[7]。结果显示峰3～峰5信息主要来自黄芩和甘草；峰6～峰7信息来自黄芩，包括黄芩苷；峰8～峰9信息来自菊花和黄柏-黄连，包括木犀草苷、盐酸小檗碱；峰10～峰14信息主要来自黄芩，包括汉黄芩素。但黄芩苷、木犀草苷在制剂图谱中的峰相对其他组分太小，故未作为参照峰。

2.6 相似度评价 采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012年版)分别对26批样品进行图谱分析，选择自动匹配法评价，生成对照指纹图谱，进行相似度计算，11家企业生产的相似度分别为0.699、0.801、0.808、0.818、0.888、0.896、0.905、0.912、0.928、0.939、0.954、0.955，范围为0.801～0.955，另一家企业生产的3批样品由于特征峰缺失，相似度较低，为0.699。

3 讨 论

用上述建立好的指纹图谱测定方法对全部收集样品进行测定，试验结果表明，对于样品收集量大于3批次的5家生产企业而言，同一企业不同批次的样品其相对保留时间和相对峰面积均呈现较好的一致性，相似度均大于0.98，说明同一企业药材来源和工艺相对稳定，成品均一性较好。但如上所述，不同生产企业间样品的样品相似度差异较大，分析认为与各企业间生产工艺具体参数、原药材品质及炮制加工等环节的不同有关；同时还存在有个别企业的样品的相似度较低，偏于正常值，测定的指纹图谱中有共有峰缺失及相对峰面积差异较大，表明组分缺失或含量偏低，这种图谱的差异不排除厂家存在减量投料或次品投料的情况。本研究不同于明目蒺藜丸中简单的HPLC含量测定和特征图谱定性分析，采用半定量的指纹图谱技术比较了本品的市售代表性企业间样品中黄酮类物质的差异。

比较了不同的方法(27%盐酸甲醇水解、聚酰胺柱、D101大孔树脂柱)，不同的洗脱剂(2倍柱体积的水洗脱、3倍柱体积的乙醇洗脱、1倍柱体积的乙醇洗脱)，结果采用聚酰胺柱纯化，选用2倍柱体积水洗脱杂质干扰，3倍柱体积乙醇洗脱待测组分，所测定的色谱峰谱图信息丰富，效果理想。

[1] 柴 军，汪佳萍，谢浙裕.高效液相色谱法同时测定明目蒺藜丸中黄芩苷、盐酸小檗碱、升麻素苷和甘草苷的含量[J].中华中医药学刊，2013,23(3):652-654.

[2] 张 磊，刘 佳，于 静,等.豨莶草指纹图谱研究和3种活性成分的含量测定[J].陕西中医, 2015,36(12):1674-1676.

[3] 李 骅，高 雅，杨 倩,等.双丹口服液的HPLC指纹图谱研究[J].陕西中医,2016,37(7):734-738.

[4] 陈莉雯，李毅民，谢瑞芳,等.黄连解毒汤HPLC指纹图谱的建立[J].陕西中医，2015,36(6):238-242.

[5] 白云娥，漆小梅，赵 华，等.聚酰胺分离金莲花总黄酮[J].中国医院药学杂志，2006,26(5):512-514.

[6] 马鸿雁，周婉珊，褚夫江，等.苦参中黄酮类成分的高效液相指纹图谱及5种成分的含量测定[J].中国中药杂志，2013,38(16)：2690-2695.

[7] 周 欣，李章万，张雪琴，等.银杏叶片剂中银杏黄酮的HPLC指纹图谱研究[J].中国药学杂志，2005,40(2)：93-95.

(收稿2016-09-19；修回2016-10-20)

△青海省药品检验检测院(西宁 810016)

@明目蒺藜丸 黄酮类 色谱法，液相

R289

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.12.048