黄芩抑菌效力生物检定法的研究

高 琳 傅 强 黄 萍 饶雅琨 司马磊

西安交通大学药学院(西安 710061)



黄芩抑菌效力生物检定法的研究

高 琳 傅 强 黄 萍△饶雅琨△司马磊△

西安交通大学药学院(西安 710061)

目的：探讨管碟法用于测定黄芩抑菌效力的可行性。方法：以庆大霉素为工作参照物、抑菌圈直径(D)为反应值，按三剂量法设计试验，对黄芩样品的抑菌效力进行测定。结果：庆大霉素的质量浓度在2.10～10.00μg/ml范围内、黄芩样品溶液的质量浓度在3.21×10﹣2g/ml～1.53×10﹣1g/ml范围内，其相应质量浓度的对数值与抑菌圈D呈现良好的线性关系(r=0.9962，0.9953)。三剂量法实验剂间变异分析及可靠性测验结果表明回归非常显著，偏离平行、二次曲线、反二次曲线均不显著，组内(碟间)差异有统计学意义；可信限为2.36%。根据庆大霉素效价值计算，黄芩药材的效价为52 U/mg。结论：管碟法能用于黄芩抑菌效力的检测，可作为黄芩品质评价的一种新方法。

黄芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)黄芩有较广的抗菌谱，在试管内对痢疾杆菌、白喉杆菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌以及脑膜炎球菌等均有抑制作用，煎剂作喉头喷雾，对脑膜炎带菌者亦有效，即使对青霉素等抗菌素已产生抗药性的金黄色葡萄球菌，对黄芩仍属敏感。在2015版《中国药典》一部主要通过测定黄芩苷的含量对黄芩的品质进行控制和评价。同样，对黄芩抗菌作用研究的报道中，大多数研究者对黄芩中的有效单体黄芩苷进行了研究，证明了黄芩苷在体外对多种临床常见病原菌具有抗菌活性。但另据文献报道，黄芩中的千纸层素-A和黄芩素对大肠杆菌也有一定的抑菌作用[1]，说明千纸层素-A和黄芩素也是黄芩抗菌作用的物质基础之一。可以看到，黄芩是一个复杂的体系，化学成分不完全明确，其抗菌作用是多组分共同作用结果，所以采用传统的西药质量控制模式即单一成分的定性与定量控制其质量[2]是不适当，不准确的。本研究尝试从“效”入手，以抗菌效力类比抗生素，采用生物检定法，综合考虑各组分的影响，对黄芩的抑菌效力进行测定[3]，以期为黄芩的质量控制和评价提供新的思路。

1 仪器与试药

1.1 仪 器 BT25S型电子天平；GHP-9160型生化培养箱；LDZX-50KBS型立式灭菌器；牛津杯(7.8mm)；WGZ-2XJ型细菌浊度计；ZY-300IV 型微生物自动测量仪；安捷伦1200型高效液相色谱仪。

1.2 试 药 庆大霉素标准品(630U/mg，批号：130326-201015；黄芩苷对照品(含量：93.3%，批号：110715-201318)；营养琼脂培养基(批号：1301232)；抗生素微生物检定培养基Ⅱ号(批号：140722)；实验用菌：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]，枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]，大肠杆菌[CMCC(B)44 103]，藤黄微球菌[CMCC(B)28 001]，短小芽孢杆菌[CMCC(B)63 202](均购于中国食品药品检定研究院)；灭菌水，三蒸水(自制)；磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，磷酸；乙醇(分析级)；甲醇(色谱级)；黄芩药材(购于西安怡康大药房、北京同仁堂、藻露堂大药房经西安市食品药品检验所雷成康主任药师鉴定)。

2 方法与结果

2.1 标准品溶液的制备 称取庆大霉素标准品31.75mg，置于1000ml量瓶内，加灭菌水溶解并稀释制成20.00μg/ml的标准品原液，备用。

2.2 供试品溶液的制备 取黄芩药材100g，粉碎成细粉，加体积分数55%乙醇1000ml，加热回流3次，每次2h，合并滤液，减压干燥，将提取物用灭菌水稀释至含生药1g/ml，备用。

2.3 测定菌株的选择及菌悬液的制备 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、短小芽孢杆菌5种标准菌株，制成浓度为1×108CFU/ml的菌悬液。采用2倍稀释法测定黄芩提取液对5种细菌的最小抑菌浓度(MIC)[3],分别为9.77×10-4，1.25×10-1，1.95×10-3，1.56×10-2和1.56×10-2g/ml。选取最敏感的金黄色葡萄球菌做为试验菌种。取金黄色葡萄球菌的营养琼脂斜面培养物，画线接种于营养琼脂斜面上，于37℃培养22 h，置于4℃冰箱保存。挑选第3代细菌的营养琼脂斜面培养物，用无菌水将菌苔洗下，制成悬液，使用细菌浊度计调节浊度为2.0麦氏比浊标准，备用。

2.4 双碟的制备 取双碟，分别注入加热融化的抗生素微生物检定培养基Ⅱ号20ml作为底层，使培养基在碟内均匀摊布，放置在水平面上待凝固。将制备好的菌悬液按1%的比例加入冷却至56℃培养基中摇匀，作为上层菌液，每个碟中加入5ml，使均匀摊布。冷却后，在每个培养皿中以等距均匀安置牛津杯，分别滴加供试品溶液和标准品溶液，用陶瓦圆盖覆盖，37℃培养适宜时间后，取出用微生物自动测量仪测量抑菌圈直径。

2.5 标准品的抑菌效价检测方法学考察 标准品溶液的制备：将标准品原液按照1∶0.8的剂间距用磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释至2.10，2.62，3.28，4.10，5.12，6.40，8.00和10.00μg/ml的待测溶液，备用。剂量反应关系考察：取制备好的双碟，在每一双碟中以等距离均匀安置牛津杯4个，用陶瓦圆盖覆盖备用。取上述待测溶液各0.3ml加样，置于37℃培养箱中培养16h，取出，用微生物自动测量仪测量各样品抑菌圈直径D值。精密度试验：取标准品原液，稀释至5.12μg/ml，按上述条件重复测定5次，精密测量各抑菌圈直径D值，计算相对标准偏差RSD为1.46%，具有较好的精密度。

稳定性试验：取标准品原液，稀释至5.12μg/ml，分别在0、1、4、8和24h，按上述条件测定，精密测量各抑菌圈直径D值，计算相对标准偏差RSD值为1.37%，标准品溶液在24h内稳定性良好。

2.6 供试品的抑菌效价检测方法学考察 供试品溶液的制备：按2倍稀释法用磷酸盐缓冲液(pH7.8)将供试品原液稀释。中心浓度的选择：将供试品稀释制成质量浓度为1.00、5.00×10-1、2.50×10-1、1.25×10-1、6.25×10-2、3.12×10-2、1.56×10-2、7.80×10-3和3.90×10-3g/ml的溶液，取准备好的双碟27只，分为9组，每组3只。每组各碟内各9只牛津杯分别滴满各质量浓度供试品溶液，在规定的温度和培养条件下培养16h，用微生物自动测量仪测定抑菌圈大小，取平均值。线性关系：取供试品原液，按照1∶0.8的剂间距用磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释成1.53×10-1、1.22×10-1、9.80×10-2、7.84×10-2、6.27×10-2、5.02×10-2、4.01×10-2和3.21×10-2g/ml的待测溶液，备用。取制备好的双碟，在每一双碟中以等距离均匀安置牛津杯4个，用陶瓦圆盖覆盖备用。取上述待测溶液各0.3ml加样，置于37℃培养箱中培养16h，取出，用微生物自动测量仪测量各样品抑菌圈直径D值。

2.7 黄芩药材抑菌效价检测 精密量取供试品原液，按1∶0.8的剂间距，用磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释成质量浓度为7.84×10-2、6.27×10-2和5.02×10-2g/ml的溶液，作为供试品溶液，另精密量取标准品溶液用磷酸盐缓冲液(pH7.8)稀释成质量浓度为4.10、5.12、6.40μg/ml的溶液，作为标准品溶液。取制备好的双碟6个，在6个牛津杯中分别滴加供试品和标准品溶液，于37℃培养16h，用微生物自动分析测量仪测量抑菌圈直径，按《中国药典》2015年版四部(通则1201 抗生素微生物检定法)中量平行反应测定法项下进行剂间分析、可靠性测验、效价及可信限计算。

2.8 HPLC法测定黄芩药材中黄芩苷的含量 按《中国药典》2015年版四部(通则0512)项下的高效液相色谱法测定[3]。色谱条件与系统适应性试验：色谱柱：Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)；流速：1.0ml/min；检测波长为280nm；柱温：30℃；进样量10μl。记录色谱图，见图1。色谱图中理论板数按黄芩苷峰计算均不低于2500。

3 结 果

3.1 剂量反应关系考察结果 以抑菌圈直径D(mm)为横坐标X，以标准品质量浓度C(μg/ml)为纵坐标Y进行线性回归，结果回归方程为：Y=0.5398X-4.7995，r=0.9962。以抑菌圈直径D(mm)为纵坐标Y，标准品质量浓度C(μg/ml)为横坐标X，线性回归，结果回归方程为：Y=1.8387X+8.9643，r=0.9962。结果表明，在质量浓度为2.10μg/ml～10.00μg/ml范围内，庆大霉素溶液浓度与抑菌圈直径D有较好的量效关系。结果见表1。

3.2 中心浓度的选择结果 测量抑菌圈直径，质量浓度为 6.25×10-2g/ml的黄芩溶液产生的抑菌圈直径为17.83mm，大小合适，故选择6.25×10-2g/ml为中心浓度。

表1 庆大霉素对金黄色葡萄球菌作用产生的抑菌圈直径D(mm)实验结果

3.3 线性关系实验结果 以抑菌圈直径D(mm)为横坐标X，以标准品质量浓度C(g/ml)为纵坐标Y进行线性回归，结果回归方程为y=0.0086x-0.0884，r=0.9953。结果表明，在质量浓度为3.21×10﹣2g/ml～1.53×10﹣1g/ml范围内，黄芩溶液质量浓度与抑菌圈直径D有较好的量效关系。结果见表2。

表2 供试品溶液对金黄色葡萄球菌作用产生的抑菌圈直径D(mm)实验结果

3.4 黄芩药材抑菌效价检测结果 黄芩药材抑菌效价检测，供试品与标准品间抑菌圈直径D(mm)比较(P>0.05),回归非常显著(P<0.01)，偏离平行不显著(P>0.05)，二次曲线和反二次曲线均不显著(P>0.05)，试验结果可靠。碟间抑菌圈直径D(mm)比较，差异有统计学意义(P>0.05)，试验误差较小。r=0.9922，可信限为2.36%。根据庆大霉素效价值计算，黄芩药材的效价为52 U/g。不同来源黄芩药材测定结果为：怡康大药房黄芩52 U/g；北京同仁堂黄芩46 U/g；藻露堂大药房黄芩58 U/g。结果见表3。

3.5 HPLC法测定黄芩药材中黄芩苷的含量 不同来源黄芩药材中黄芩苷含量测定结果为：怡康大药房黄芩12.7%；北京同仁堂黄芩13.1%；藻露堂大药房黄芩12.3%，黄芩苷含量的高低与抑菌效价并无直接关系。

表3 黄芩药材效价实验结果

4 讨 论

对比本文中管碟法与HPLC法的结果，可以看出，黄芩苷含量的高低与黄芩药材抗菌效力的强弱并无直接关系，更加说明以往只研究黄芩中黄芩苷这一单一组分的体外抗菌活性是不全面的，用黄芩苷的含量来代表黄芩的抗菌效力乃至黄芩的质量是不科学、不可行的。本实验可以更直观的反映出黄芩药材的抑菌能力，也更加符合中药质量评价中以效入手的理念。已有报道[4]以枯草芽孢杆菌作为目标菌建立黄芩炮制品的生物检定法，本文选择了金黄色葡萄球菌为实验菌种，金葡菌和枯草芽孢杆菌都是生物检定法中的常用菌种，从微生物形态上讲，金葡为球菌，枯草为产芽孢杆菌，区分了杆菌、球菌、芽孢的不同细菌形态受到黄芩中抑菌成分的影响。另外金葡菌是医院内感染最主要的感染源，且对于其抗生素耐药性的报道越来越多，具有抗菌效力的中药未来会成为治疗耐药金葡菌感染的新途径，所以选择金葡菌作为目标菌，更直观，结果更具有参考价值。本次试验的关键之一在于标准品的选择。本文中标准品系指用于生物检定、抗生素或生物药品中含量或效价测定的标准物质，以效价单位(U)表示[5]。已有报道[6]以对照药材作为标准品，对照药材的优点在于与供试品在组成和成分上最为接近，但对照药材的主要用途是用来鉴定药材的真伪，不同批次之间各差异较大，只能用于定性不能用于定量，所以该方法缺乏可靠性且不可推广。在生物检定法中，要求供试品与标准品具有同质性。由于中药成分复杂，所以要找到化学性质，成分，比例完全相同的参照物是非常困难的，虽然从化学成分上来说，抗生素与中药材是不相同的，但从抗菌效力来说，它们是具有广义同质性的，即具有相同的抗菌效力。已有报道以缩宫素作为标准品对益母草药材进行生物检定。抗生素标准品的优势在于具有明确的生物效价，可以成为一个衡量标准和中介标准，既可把中药材的抗菌能力与抗生素等效比较，又可沟通不同药材的比较。所以本文选择庆大霉素标准品作为试验的标准品对黄芩药材抗菌效力进行评价以期为中药的生物检定提供新的思路。

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[2] 郭耀武，杨瑞瑞，李 晗.陕西商洛产黄芩药材的质量评价[J].陕西中医，2012,33(8)：1074-1075.

[3] 李会芳，王伽伯，孙 琴，等.生物效价检测在中药品质及药性研究中的应用[J].中医杂志，2012，53(3)：190-192.

[4] 郭玉东，王志斌，周建平，等.中药生物活性测定法中标准品建立的研究[J].药物分析杂志，2013，33(4)：706-708.

[5] 郑敏霞，沈 洁，丰素娟.生物效价检测研究进展[J].中国现代应用药学，2011,28(6)：511-514.

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(收稿2016-07-17；修回2016-09-03)

△西安市食品药品检验所(西安 710054)

黄芩 检测 细菌

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.12.049