猪蓝耳病病毒、圆环病毒和沙门氏菌混合感染的实验室诊断

高　琦，王　琦，倪宏波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江　大庆　163319）

猪蓝耳病病毒、圆环病毒和沙门氏菌混合感染的实验室诊断

高琦，王琦，倪宏波⋆

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319）

随着养殖规模的不断扩大，猪群发病往往不是由单一病原所致，而是以两种或两种以上的病原相互协同作用所造成的。感染猪群常见的病原有猪瘟病毒、蓝耳病病毒、圆环病毒、沙门氏菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪链球菌、巴氏杆菌和嗜血杆菌等，并经常发生几种病原混合感染的情况，导致猪群的高发病率和高死亡率，危害极大。本文通过对某猪场病死仔猪进行病理解剖和实验室诊断，确诊其为蓝耳病病毒、圆环病毒和沙门氏菌混合感染。

蓝耳病病毒；圆环病毒；沙门氏菌；混合感染

近年来，由于生猪生产规模越来越大，加上频繁的调入转出，猪病的动态也越来越复杂，“新病”越来越多[1]。常常是多种病毒、细菌混合感染或继发感染，导致高发病率和死亡率，并且控制难度增大，经济损失严重[2]。猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome）是一种高度接触性传染病，呈地方流行性。PRRSV只感染猪，各种品种、不同年龄和用途的猪均可感染，但以妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感。患病猪和带毒猪是本病的重要传染源。感染猪的流动也是本病的重要传播方式[3]。现已知猪圆环病毒（Circovirus）有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒，PCV2为致病性的病毒。猪对PCV2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪[4]。猪沙门氏菌病又名仔猪副伤寒，是由沙门氏菌属细菌引起的仔猪的一种传染病，主要表现为败血症和坏死性肠炎，有时发生脑炎、脑膜炎、卡他性或干酪性肺炎[5]。

大庆市某猪场突发传染性疾病，送检的病死猪经病理剖检和实验室诊断，确诊为PRRSV、PCV2和沙门氏菌混合感染，现报告如下。

1　发病情况

该猪场自繁自养14头母猪，育肥猪200头左右，各个生产时期的猪分舍饲养。接种疫苗种类为猪瘟疫苗、伪狂犬疫苗、口蹄疫疫苗、细小病毒病疫苗、水肿疫苗。猪场发病率为10%～15%，出现1头病死猪。

2　临床症状

母猪出现精神沉郁、食欲下降和生产性能下降，育肥猪表现为轻度呼吸系统症状，少数出现咳嗽及耳尖皮肤出现深紫色，发病猪出现扎堆现象。

3　剖检病理变化

剖检可见气管、支气管充满泡沫，喉头表面有广泛出血点，胸腹腔积水较多；肺脏肿胀、坚硬或性病变；肝脏肿大、表面有暗红色出血斑；盲似橡皮，肺泡有出血斑，肺尖叶和心叶萎缩或实质肠和结肠黏膜充血和出血，黏膜上覆盖一层弥漫性、坏死性、腐乳状物质、剥开见底部红色、边缘不规则的溃疡面。

图1　喉头广泛出血点图Fig.1　W idely hem orrhagic spot

图2　肺脏肿胀变硬、出血Fig.2　Enlargem ent and hemorrhage of the larynx on the lung of the sw ine

图3　肝脏肿大充血出血Fig.3　En largem ent and hemorrhage

图4　肠黏膜出血Fig.4　Hemorrhage on the intestinal on the liver of the sw ine m ucosa o f the sw ine

4　实验室诊断

4.1涂片染色镜检将细菌先经碱性染料结晶紫染色，后经碘液媒染，用酒精脱色，脱色后再用复红染料进行染色。在光学显微镜下，分离菌株为革兰氏阴性，粉红色两端钝圆，中等大小的直杆菌。

图5　粉红色两端钝圆中等大小的直杆菌Fig.5　Red ends obtuse medium-sized straight bacillus

4.2鉴别培养培养用接菌环挑取肠内容物分别接种于SS琼脂鉴别培养基和麦康凯鉴别培养基上，置37℃恒温箱中需氧培养24h，观察菌落形态。

图6　SS琼脂鉴别培养基Fig.6　SalmonellaShigellaagar

图7　麦康凯鉴别培养基Fig.7　MacConkeyAgar

在SS琼脂鉴别培养基上为无色菌落中心是黑色，可鉴别为沙门氏菌；在麦康凯鉴别培养基上为无色菌落，初步诊断为沙门氏菌。

4.3生化试验取硫化氢、葡萄糖、蕈糖、阿拉伯糖、赖氨酸脱氢酶、尿素酶、枸橼酸盐、鸟氨酸脱氢酶生化管各2只。将每种生化管的其中1只接入细菌菌落，置于37℃恒温箱中培养24h。取出生化管，将试验管与对照管进行对比，观察试验管的颜色变化。

生化管发酵试验结果如下：硫化氢出现黑色沉淀；葡萄糖颜色变黄；蕈糖颜色变黄；阿拉伯糖颜色变黄；赖氨酸脱氢酶颜色变紫；尿素酶颜色变粉红；枸橼酸盐颜色变蓝；鸟氨酸脱氢酶颜色变紫。综合以上结果分离菌株鉴定为沙门氏菌。

图8　生化试验Fig.8　Biochemicaltests

4.4PPCCRR检测将新鲜的肝脏组织进行研磨，用AXYGEN提取试剂盒提取DNA和RNA。将提取出的RNA进行反转录，得到cDNA。以组织中提取的病毒DNA以及病毒RNA反转录的cDNA为模板，分别选用猪瘟、高致病性蓝耳病、普通蓝耳病、圆环病毒、伪狂犬的特异性引物进行PCR鉴定。PCR结果经琼脂糖凝胶电泳分析如图9所示。

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

其中，第2泳道230bp左右有一条带，与高致病性蓝耳病病毒目的扩增片段大小相符；第3泳道320bp左右有一条带与普通蓝耳病病毒片段相符；第4泳道493bp左右有一条条带，与圆环病毒片段相符。

4.5药敏试验用酒精灯火焰灭菌后的镊子取出药敏片，贴到已涂菌的平皿培养基表面。将平皿培养基置于37℃温箱中培养24h后，观察结果。

药敏试验结果显示硫酸头孢喹肟、盐酸头孢噻呋、头孢唑啉高度敏感。

图9　PCR检测结果Fig.9　PCR Detection results

表1　引物序列Table1　Sequence

5　讨论

5.1发病原因对该猪场仔猪的发病原因进行调查发现，该猪场饲养管理水平较低，饲养密度较大；环境消毒不彻底，排泄物没有无害化处理；免疫程序混乱，没有对猪群进行过抗体水平检测来判断猪群中是否存在病源感染。当环境骤变时，猪体抵抗力下降，病原侵入猪体造成严重损失[6]。

5.2防治措施由于本猪场散发了蓝耳病和圆环病毒病，提示猪场疫苗免疫还存在漏洞，患病的猪将成为传染源，对其他猪群构成危害[7]。一旦疫区未患病猪免疫力降低，就会被感染而患病，这样就随时有暴发传染病的危险[8]。因此，一般情况下对没有发病的同群猪常应用大剂量的疫苗，一方面是强烈刺激机体产生抗体；另一方面是疫苗抗原的占位作用，能阻止强毒对其他正常细胞和组织的侵袭和毒害；而且，疫苗抗原刺激机体产生干扰素，会抑制病毒的繁殖[9]。根据实验室进行的药敏试验检测结果可知，防治本猪场的细菌性疾病可用硫酸头孢喹肟、盐酸头孢噻呋、头孢唑啉进行治疗，并会产生较好的治疗效果。

表2　药敏试验结果Tab le2　Drug suscep tibility test results

6　结论

通过病理解剖和实验室诊断，确诊该猪场发生了蓝耳病病毒、圆环病毒和沙门氏菌混合感染，与商品化试剂盒的检测结果相符合。

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Diagnosis of them ixed infection of PRRS、Circovirus and Salmonella of sw ine

Gao Qi,Wang Qi,Ni Hongbo*
(Col lege of Animal Science and Veterinary Medicine,Hei longj iang Bayi Agricul tural University,Heilongj iang Daqing163319)

With the continuous expansion of breeding scale,the incidence of diseases in swine herds are caused by two or more pathogens in the form of mutual cooperation rather than certain pathogen.There are some common pathogens such as circovirus,Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,swine fever virus,haemophilus parasuis,streptococcus,pasteurel la and so on, which lead to high morbidity and mor tality in swine herd by mixed infection.In this paper,we diagnosed piglets died on cer tain farm with mixed infection of PRRSV,Circovirus and Salmonel la by pathological measurement and laboratory diagnosis.

PRRSV;Circovirus;Salmonel la;Mixed infection

S858.28

B

1672-9692(2016)02-0036-05

2015-01-08

高琦（1993-），女，在读硕士，从事分子病原学致病机理研究。

倪宏波（1972-），男，博士，教授，主要研究方向为分子病原学与免疫学。