黄连素联合塔斯品碱衍生物对肝癌细胞迁移及凋亡的影响

马玉娇,杨天枫,张彦民,代秉玲

(西安交通大学 医学部药学院, 陕西 西安 710061)



·生命科学·

黄连素联合塔斯品碱衍生物对肝癌细胞迁移及凋亡的影响

马玉娇,杨天枫,张彦民,代秉玲

(西安交通大学 医学部药学院, 陕西 西安 710061)

应用MTT法检测黄连素联合Ta1722对SMMC-7721细胞活力的影响,以金正均法计算q值判断两药相互作用。根据细胞划痕实验与Hoechst染色实验,研究黄连素联合Ta1722对SMMC-7721的迁移及凋亡的影响。使用western blot检测迁移和凋亡相关蛋白表达。黄连素浓度在3.125～25μmol/L范围内、Ta1722浓度在20μmol/L时,两者为协同作用,黄连素联合Ta1722对SMMC-7721细胞的迁移无明显作用,迁移相关蛋白NF-κB,CXCR4,MMP2,MMP9表达无明显变化。黄连素联合Ta1722可诱导SMMC-7721细胞凋亡,上调P53,上调促凋亡蛋白Bax,下调抑凋亡蛋白Bcl-2。黄连素联合Ta1722对SMMC-7721细胞的迁移无明显作用,但可诱导SMMC-7721细胞凋亡,其机制可能是其上调抑癌基因P53的表达,从而导致促凋亡Bax上调,抑凋亡蛋白Bcl-2下调有关。

黄连素；细胞迁移；细胞凋亡

肝癌是威胁我们生命健康的主要恶性肿瘤之一,根据2012年统计,发展中国家肝癌新增人数男性、女性分别排名第2位和第6位,死亡人数分别位居第2位和第5位,而我国也正是全球肝癌发生率最高的地区之一[1]。

转移是肝癌的基本特征,是影响肝癌治疗效果的重要因素。凋亡是一种广泛存在的生物现象,许多疾病尤其是肿瘤的发生发展与细胞凋亡的失衡有关。本课题组以往的研究发现,塔斯品碱衍生物(Ta1722)能够较好地抑制肿瘤细胞生长,对SMMC-7721肝癌细胞尤为敏感[2]。大量文献报道,黄连素(Berberine)在抗肝癌作用上具有较好药理活性,在诱导凋亡、抑制迁移、抑制增殖方面均有一定效果[3],且与放化疗联用时,可增强肿瘤细胞对传统放化疗的敏感性[4]。因此,本课题以联合用药的方式,研究黄连素联合Ta1722对肝癌细胞SMMC-7721迁移及凋亡的影响。

图1 Ta1722与黄连素结构式(A:Ta1722 B:黄连素)Fig.1 The structural formula of Ta1722 and Berberine (A: Ta1722 B: Berberine)

1 材料与仪器

Ta1722由西安交通大学食品药品研究与检测中心合成,RPMI1640培养基(干粉)购自美国 Sigma-Aldrich 公司,胎牛血清购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司,胰蛋白酶购自美国 Amresco 公司,SDS-PAGE制胶试剂盒购自陕西先锋生物有限公司。

2 方 法

2.1 细胞培养

将本实验室保持的SMMC-7721细胞,培养于含有10%(体积分数)胎牛血清,100U/mL青霉素与链霉素的RPMI1640培养基中,在37 ℃,5%(体积分数)CO2条件下培养,隔天换液,3-4天胰酶消化传代培养。

2.2 MTT试验

取对数生长期的细胞胰酶消化,计数,接种于96孔板中(4×104个/孔),细胞悬液体积为180μL/孔。每组设5个平行孔,在37℃,5%(体积分数)CO2条件下培养24h后加药。设不接种细胞的空白组、阴性对照组、黄连素单独用药组、黄连素联合Ta1722组,其中黄连素组的终浓度为3.125，6.25，12.5，25，50，100μmol/L，联合用药组终浓度设置见表1,再次放入培养箱中继续培养48h,吸弃培养基,以无血清的RPMI1640稀释MTT至0.5mg/mL,每孔加200μL,37 ℃孵育4～6h,小心吸去MTT(噻唑蓝),每孔加入二甲基亚砜150μL,摇床上震荡15min,于490nm处检测吸光度值。按照以下公式计算细胞活力。

(1)

采用金正均法判断两药联用是否具有协同作用。

q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea*Eb)

(2)

式(2)中 Ea+b为联合处理组的抑制率, Ea，Eb分别为a药和b药单独处理组的抑制率。 若q值在0.85～1.15间为两药联用单纯相加, 若q>1.15为有协同作用, 若q<0.85表示两药联用有拮抗作用。

2.3 细胞划痕实验

取对数期生长的SMMC-7721细胞,接种于12孔板。培养细胞长至70%～80%时,用200μL枪头在孔板中央划出一道宽度均匀的划痕,PBS缓冲溶液洗去漂浮细胞,加入完全培养基,拍照,记作0h。加入Ta1722,黄连素及联合组的浓度分别为20,25,20+25μmol/L,设置阴性组,加入相同体积的培养基。分别在24h和48h拍照。

2.4 Hoechst染色实验

取对数生长期的细胞,消化成单细胞混悬液后接种于24孔板,培养24h贴壁后加入Ta1722,黄连素及联合组的浓度分别为20,25,20+25μmol/L,设置阴性组加入相应体积的无血清培养基。培养48h后PBS缓冲液洗2次,每次3min,每孔加300μL Hoechst 33258染色液,染色5min后,三蒸水冲洗干净,在340nm波长紫外光下激发,拍照记录荧光。

2.5 Western blot实验

取对数生长期的SMMC-7721接种于6孔板,培养24h贴壁后分别加入Ta1722,黄连素及联合组,其浓度为20,25,20+25μmol/L,设置阴性组加入相应体积的无血清培养基。药物作用48h后,PBS缓冲液洗2次,加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解30mim,于细胞破碎仪上冰上破碎,4℃,12 000g,离心10min,取上清,BCA(bicinchoninic acid)法测定蛋白浓度。其余蛋白加入上样缓冲液,沸水中煮沸变性5min,10%SDS-PAGE胶电泳,半干电转法将蛋白转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉(TBST缓冲溶液稀释)室温封闭2h后,加入相应的一抗4℃ 孵育过夜。取出PVDF膜TBST缓冲溶液洗4次,每次5min。加入二抗(稀释比例1∶20 000，体积比)37℃ 1h,TBST缓冲溶液洗4次,每次5min。ECL化学发光检测条带,用GAPDH作内参。

2.6 数据统计

所有数据均采用平均值±标准误(means ± SEM)表示,用SPSS18.0统计软件进行统计学分析,P<0.05表示差异有显著性。

3 结 果

3.1 联合用药对SMMC-7721细胞的抑制作用

随着黄连素剂量的不断增大,黄连素单独用药组与联合用药组对细胞的抑制作用不断增强,且联合组的抑制作用明显强于黄连素单独用药组(P<0.05),见图2。金正均法检测显示除最后两大浓度组外,其余各组q>1.15,见表1。Ta1722联合黄连素在Ta1722为20μmol/L，黄连素浓度在3.125～25μmol/L时，其联合效果均为协同作用。

图2 黄连素单独与联合用药对SMMC-7721细胞增殖的影响(*P<0.05)Fig.2 The effect of Berberine and combination on proliferation of SMMC-7721(*P<0.05)

表2 黄连素,Ta1722单独及联合对SMMC-7721细胞的抑制率与联合指数q值(x±s,n=3)

Tab.2 The proliferation inhibition rate and combination index q of Berberine, Ta1722 and combination to SMMC-7721(x±s,n=3)

浓度/μmol·L-1BBRTa1722+BBRq值2011.0192±3.727---3.125-6.1440±1.61223.5230±5.5481.436.25-9.0114±0.34632.1329±2.8421.6912.5-15.3222±3.54638.6972±4.2741.5725-38.3474±0.96554.4728±1.9071.2150-50.8764±2.05763.8569±1.5141.13100-64.4710±1.48874.8966±1.0511.10

3.2 联合用药对SMMC-7721细胞迁移的影响

细胞划痕实验结果表明,黄连素单独用药组与黄连素联合Ta1722组抑制SMMC-7721细胞迁移的效果无明显差别。同时,western blot也证实其迁移相关蛋白NF-κB,CXCR4,MMP2,MMP9均无明显差异,见图3。Ta1722联合黄连素对SMMC-7721细胞迁移无明显影响。

A 细胞划痕图； B 细胞迁移相关蛋白表达图图3 Ta1722及BBR单独、联合用药对SMMC-7721细胞迁移的影响Fig.3 The effect of Ta1722, Berberine and combination on migration of SMMC-7721

3.3 联合用药对SMMC-7721细胞凋亡的影响

Hoechst染色实验结果可以看出,联合用药组凋亡细胞数明显增加。同时western blot结果显示,抑癌蛋白p53上调,p38下调,促凋亡蛋白Bax上调,抑凋亡蛋白Bcl-2下调,见图4。Ta1722联合黄连素可以诱导SMMC-7721细胞凋亡。

A Hoechst染色:a. control b. Ta1722 c.BBR d. Ta1722+BBR B 细胞凋亡相关蛋白表达图图4 Ta1722及BBR单独、联合用药对SMMC-7721细胞凋亡的影响Fig.4 The effect of Ta1722, Berberine and combination on apoptosis of SMMC-7721

4 讨 论

化疗是肝癌治疗的主要手段之一,因单一药物化疗的毒副作用和耐药性较强,目前临床多采用联合药物化疗。中药源于自然,不良反应小,不仅能够提高患者的免疫功能,同时可以弥补手术、化疗、生物治疗等不足,与放、化疗联用时增强疗效[5]。黄连素是从中草药黄连、黄柏等植物中提取分离得到的一种异喹啉类生物碱,最早用于临床上主要治疗肠道感染、清热解毒等。20世纪70年代日本学者最先提出黄连素具有抗肿瘤作用后,目前已发现黄连对多种肿瘤如肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌等均具有抑制作用[3]。Ta1722是本课题组根据从药用植物红毛七中分离得到的塔斯品碱为基本骨架,合成得有较好生物活性的化合物。研究发现Ta1722对SMMC-7721,A549,MCF-7,LOVO等细胞均具有良好的抑制活性,并且发现Ta1722可以抑制SMMC-7721细胞血管生成,下调VEGFR-2[2]。因此,本实验将两种对于肝癌细胞SMMC-7721有较好药理活性的化合物联合用药,研究其对SMMC-7721的联合效果。结果表明,黄连素浓度在3.125～25μmol/L范围内、Ta1722浓度在20μmol/L时，两者具有协同作用,抑制SMMC-7721细胞增殖,且具有浓度依赖性。

肿瘤的侵袭与转移是恶性肿瘤重要的生物学特征,是一个多步骤的复杂过程。基质金属蛋白酶(MMPs)是人体降解细胞外机制的主要酶类,参与肿瘤演变的众多生理和病理过程[6]。Ta1722联合黄连素对基质金属蛋白酶MMP2,MMP9的影响无显著性,且细胞划痕实验也无显著性,因此,Ta1722联合黄连素对SMMC-7721的抑制作用可能与细胞的迁移无关。

正常人体组织、细胞的生长受到精确的调控。而肿瘤细胞,通过研究证实,肿瘤细胞的无限生长是肿瘤细胞凋亡受抑制的结果,因而凋亡障碍同肿瘤的发生、发展具有密切的关系[7]。Bcl-2家族成员在细胞凋亡的线粒体通路中起重要调控作用。Bcl-2具有抗凋亡作用,主要阻止细胞色素C等凋亡因子从线粒体中释放,使肿瘤组织中最主要的抑制凋亡蛋白之一,在多数肿瘤中Bcl-2表达水平升高[8]。Bax与Bcl-2作用机制相反具有促凋亡作用,通过线粒体上的电压依赖性离子通道的相互作用,介导细胞色素C的释放[9]。P53可以控制提高Bax/Bcl-2比例,即上调Bax与下调Bcl-2的表达水平,来完成促进细胞凋亡的作用。Ta1722联合黄连素能够上调P53的表达,下调抑凋亡蛋白Bcl-2,上调促凋亡蛋白Bax。表明Ta1722联合黄连素诱导SMMC-7721细胞凋亡,可能与P53,Bcl-2及Bax表达量的变化有关。

Ta1722与黄连素联合用药,可以显著提高其对SMMC-7721细胞的抑制效果,且诱导细胞凋亡。由此可见,黄连素确实可以增强肿瘤细胞对一些化疗药物的敏感性。

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(编 辑 陈镱文)

Effects of Berberine combined with the tlerivative of taspine on apoptosis and migration of liver cancer cells

MA Yujiao, YANG Tianfeng, ZHANG Yanmin,DAI Bingling

(Health Science Center, College of Pharmacy, Xi′an Jiaotong University, Xi′an 710061， China)

Cell proliferation was assessed by MTT assay. The interaction of Berberine and Ta1722 was estimated by Jin Zheng jun′s method. Wound Scratch assay and Hoechst assay were used to study the effect of Berberine combined with Ta1722 on apoptosis and migration of SMMC-7 721 liver cancer cells. There is a synergic effect between the Berberine and Ta1722 when concentrations of Berberine change from 3.125μmol/L to 25μmol/L and the concentration of Ta1 722 is 20μmol/L. There is no significantly effect on cell migration, as well as NF-κB, CXCR4, MMP2 and MMP9 expression. However, Berberine combined with Ta1722 induced apoptosis which could upregulate P53 and Bax expression and downregulate Bcl-2 expression. Berberine combined with Ta1722 has no significantly effect on cell migration, but can induce apoptosis on SMMC-7721, this effect may be related to the increase of the expression of P53 which leads to the increase of the expression of Bax, reducing the expression of Bcl-2.

Berberine； migration； apoptosis

2016-07-26

国家自然科学基金资助项目(81370088 ; 81503101)

马玉娇，女，陕西西安人，从事抗肿瘤化合物药理学活性研究。

代秉玲，女，山西吕梁人，从事抗肿瘤化合物药理学活性研究。

R966

A

10.16152/j.cnki.xdxbzr.2016-05-015