二次通用旋转试验设计优化小米菜色素提取工艺

张一鸣，杨士花，黄佳琦，黄勇桦，李海平，李 淳，李永强

(1云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201;2云南农业大学外语学院，昆明 650201;3武定县食品药品监督管理局，云南楚雄彝族自治州 651600;4永平县食品药品检验检测院，云南大理白族自治州 672600)



二次通用旋转试验设计优化小米菜色素提取工艺

张一鸣1，杨士花2，黄佳琦1，黄勇桦1，李海平3，李 淳4，李永强1

(1云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201;2云南农业大学外语学院，昆明 650201;3武定县食品药品监督管理局，云南楚雄彝族自治州 651600;4永平县食品药品检验检测院，云南大理白族自治州 672600)

以小米菜为材料，以吸光度为指标，在单因素试验的基础上采用二次通用旋转试验设计，对小米菜色素的提取工艺进行了优化，建立了色素提取效果与提取温度、液料比、提取时间的二次回归数学模型，并利用该模型探讨了各因素对色素提取效果的影响。结果表明：小米菜色素初步定性为复合色素，可能包含黄酮醇和叶绿素。

小米菜色素；初步定性；二次通用旋转试验；提取工艺优化

从生物体中提取的天然色素，相比于合成色素，具有更高的安全性及保健功效，且着色时色调更接近天然物质颜色[1-8]。小米菜是一种高温短日照作物[9，10]，因富含多种微量元素及维生素，同时，小米菜茎、叶内色素含量较高，产量高且容易种植，故适于作为天然色素提取原料[9-11]。本研究以小米菜为试验材料，根据最大吸收波长和最佳提取溶剂对小米菜色素进行初步定性，利用提取温度、液料比和提取时间进行单因素试验，在此基础上采用二次通用旋转试验设计，优化小米菜色素的提取工艺，为小米菜色素的开发提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米菜，于2015年1月采自墨江，采集后置于4℃备用。乙醇、石油醚等溶剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV—1800PC型紫外分光光度计，上海美普达仪器有限公司；XMTD—4000型电热恒温水浴锅，北京永光明医疗仪器有限公司；FA1004A型电子天平，上海精天电子仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小米菜色素的制备 将小米菜清洗后，称取一定量的小米菜，研磨，在一定条件下提取3次，过滤，合并滤液，得到小米菜色素溶液。

1.3.2 最大吸收波长和最佳提取溶剂的确定 通过预试验，该色素微溶于石油醚、乙醚等有机溶剂，易溶于醇类溶剂，参考相关文献推测该色素可能为黄酮醇化合物[12-14]，故在试验中选择80%乙醇溶液作为一种提取溶剂。准确称取3份2 g样品置于研钵中，分别加入30 mL蒸馏水、石油醚、80%乙醇溶液，研磨、过滤，分别用不同的提取溶剂定容于50 mL容量瓶中，测定吸光度，确定该色素的最大吸收波长和最佳提取溶剂。

1.3.3 单因素试验 固定反应条件为液料比20∶1 (mL/g)、提取温度40℃，考察不同提取时间(10、20、30、40、50 min)对色素提取效果的影响；固定反应条件为提取时间30 min、提取温度40℃，考察不同液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g)]对色素提取效果的影响；固定反应条件为提取时间30 min、液料比20∶1mL/g，考察不同提取温度(20、30、40、50、60℃)对色素提取效果的影响。以吸光度为指标进行单因素试验，考察各因素对色素提取效果的影响。所有试验均重复3次。

1.3.4 二次通用旋转试验设计 选取提取温度、液料比和提取时间3个因素，利用DPS数据处理软件进行二次通用旋转试验设计，并进行统计分析，确定该色素的最佳提取工艺。

2 结果与分析

2.1 最佳提取溶剂和最大吸收波长的确定

对以80%乙醇、蒸馏水和石油醚提取的色素溶液在200～800 nm范围内进行全波长扫描。因为石油醚提取的色素溶液溶解性很低，故仅将80%乙醇和蒸馏水提取色素溶液进行分析。由图1可以看出，用80%乙醇和水提取的小米菜色素在325、436、669 nm处均有明显吸收峰，说明该色素易溶于80%的乙醇和蒸馏水，为水溶性色素，且80%乙醇提取液吸收峰高于水提取液，故选取80%乙醇作为提取溶剂。小米菜色素在波长为325、436、669 nm有3个吸收峰，根据文献[12-15]可知，325 nm处为黄酮醇类色素特征吸收峰、669 nm处为叶绿素特征吸收峰，故初步定性小米菜色素为复合色素，可能包含黄酮醇色素和叶绿素。查阅文献不能根据最大吸收峰对436 nm色素进行定性，需要利用质谱和核磁共振等技术进行进一步结构鉴定。本试验对669 nm波长的色素不进行讨论，仅对325 nm和436 nm波长下的色素进行研究。

图1 小米菜色素的吸收光谱

2.2 单因素试验

2.2.1 提取温度对色素提取效果的影响 由图2可见，在不同提取温度下，436 nm处吸光度均大于325 nm吸光度，并且随着提取温度的上升，色素溶液在2个波长下的吸光度均呈现先上升后下降的趋势，在40℃时达到最高，吸光度值分别为0.79、0.19。随着提取温度的增加，色素分子吸热后活动加快，色素溶出率增加，吸光度呈现上升趋势，当温度超过40℃后，色素可能在高温条件下不稳定，导致色素分解，吸光度下降，提取率降低，故选取40℃为提取温度较适宜。

图2 提取温度对吸光度的影响

2.2.2 液料比对色素提取效果的影响 由图3可见，在不同液料比下，436 nm处吸光度均大于325 nm吸光度，并且随着液料比的上升，色素溶液在2个波长下的吸光度均呈逐渐增大趋势，液料比大于20∶1 mL/g后，吸光度增大趋势不明显。随液料比的增加，色素溶出率也增高，在较高的液料比下，色素基本溶出完全，故增加液料比后色素溶液的吸光度变化不再明显。从减少耗能及提取溶剂用量等方面考虑，选择20∶1 mL/g的液料比比较理想。

图3 液料比值对吸光度的影响

2.2.3 提取时间对色素提取效果的影响 由图4可见，在不同提取时间下，436 nm处吸光度均大于325 nm吸光度，并且随着提取时间延长，色素溶液在2个波长下的吸光度均呈现先上升后下降的趋势。在20 min时达到最高，吸光度值分别为0.96、0.52。随提取时间的增加，溶出的色素也会增加，吸光度逐渐变大，到达一定提取时间时，色素基本提取完全，但受光、氧气等因素影响，色素可能会发生分解，导致吸光度下降。故选取提取时间为20 min较适宜。

图4 提取时间对吸光度的影响

2.3 数学模型的建立与检验

利用DPS软件对表1、表2试验结果进行分析，得到二次回归模型为：

在325 nm波长下：Y1=0.575 71+0.126 49X1+0.027 93X2+0.066 69X3-0.040 88X12-0.039 47X22-0.013 83X32-0.004 00X1X2-0.018 00X1X3-0.002 25X2X3

在436 nm波长下：Y2=1.485 01+0.265 83X1+0.049 06X2+0.155 74X3-0.199 05X12-0.149 37X22-0.141 24X32+0.060 12X1X2+0.060 37X1X3+0.004 12X2X3

根据表3可知，拟合检验F2=39.795>F0.01(9，10)=4.95，达到极显著水平，失拟检验F1=4.451

根据试验结果进行方差分析(表4)可知，在436 nm波长时，二次回归模型方程能够准确反映提取温度、液料比和提取时间与色素吸光度的关系。

表1 因素水平编码

表2 二次通用旋转试验方案及试验结果

表3 方差分析(325 nm)

表4 方差分析表(436 nm)

2.4 二次通用旋转试验设计[16-22]

2.4.1 主因子效应分析 根据回归方程的偏回归系数绝对值大小断定在325 nm和436 nm波长下，回归方程在试验取值范围内3种因素对色素提取效果作用大小依次为：X1(提取温度)>X3(提取时间) >X2(液料比)，且全为正效应。

2.4.2 单因子效应分析 在325 nm波长下的偏回归模型中，将3个因素中的2个固定在零水平，对数学模型进行降维分析，得到以其中1个因素为决定变量的偏回归模型：

Y1=0.575 71+0.126 49X1-0.040 88X12

(1)

Y2=0.575 71+0.027 93X2-0.039 47X22

(2)

Y3=0.575 71+0.066 69X3-0.013 83X32

(3)

(1)-(3)式，二次项系数都是负值，其曲线均是开口向下的抛物线，说明色素的提取率将随着提取温度、液料比和提取时间增加，表现出先增后减的趋势，即这3个因素均存在最佳值。

在436 nm波长下的偏回归模型中，其分析结果与325 nm波长下的吸光度的偏回归模型一致((4)-(6)式)。

Y1=1.485 01+0.265 83X1-0.199 05X12

(4)

Y2=1.485 01+0.049 06X2-0.149 37X22

(5)

Y3=1.485 01+0.155 74X3-0.141 24X32

(6)

2.5 数学模型寻优[23-27]

2.5.1 变量轮换直接寻优 根据已建立的数学模型，在-1.682≤Xi≤1.682 ( i =1，2，3)范围内，对125个方案进行统计寻优。在325 nm波长下，吸光度最高值0.78，对应各因素取值提取温度74℃、液料比20∶1 (mL/g)、提取时间36.8 min。在436 nm波长下，吸光度最高值1.57，对应各因素取值为提取温度60℃、液料比20∶1mL/g、提取时间30 min。

2.5.2 频率分析及统计寻优 变量轮换直接寻优法没有考虑到实际生产中的随机因素，因此，需要用计算机对不同组合进行模拟试验。在325 nm波长下，获得大于临界值0.51的方案53个，由表5可以看出，在95%的置信区间内，吸光度大于0.51的优化方案为提取温度为56.82～64.18℃、液料比为19.41∶1～22.425∶1、提取时间为21.94～27.94 min。将优化方案结合实际生产情况定为提取温度为60℃、液料比为20∶1 (mL/g)、提取时间为25 min。对此优化方案进行试验验证，色素溶液的吸光度为0.50，与优化理论值0.51较接近，进一步证实了方案的可靠性。在436 nm波长下，获得大于临界值1.15的方案27个，由表6可以看出，在95%的置信区间吸光度大于1.15的优化方案为：提取温度为51.04～61.2℃、液料比为18.55∶1～21.45∶1 mL/g、提取时间为23.89～30.01 min。将优化方案结合实际生产情况定为：提取温度为55℃、液料比为20∶1 (mL/g)、提取时间为27 min。对此优化方案进行试验验证，色素溶液的吸光度为1.14，与优化理论值1.15较接近，进一步证实了方案的可靠性。

表5 方案优化Xi取值频率分布(325 nm)

3 结论

小米菜色素是一种水溶性色素，最佳提取溶剂为80%乙醇溶液，在325、436、669 nm处均有最大吸收峰，初步定性为可能包含黄酮醇色素和叶绿素的复合色素。最佳提取工艺为：在325 nm波长下，提取温度为60℃、液料比为20∶1 mL/g、提取时间为25 min；在436 nm波长下，提取温度为55℃，液料比为20∶1 mL/g、提取时间为27 min。◇

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(责任编辑 李燕妮)

Extraction Technology Optimization of Amaranthus paniculatus Pigments by Quadratic General Rotary Design

ZHANG Yi-ming1，YANG Shi-hua2，HUANG Jia-qi1，HUANG Yong-hua1，LI Hai-ping3，LI Chun4，LI Yong-qiang1

(1College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；2College of Foreign Languages，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；3WudingCounty’s Food and Drug Administration，Wuding 651600，China;4YongpingCounty’s Food and Drug Testing，Yongping 672600，China)

The preliminary qualitative ofAmaranthusPaniculatusL.pigments using organic solvent method were studied by the comparison of the pigment solubility in different solvents and the maximum absorptions. According to single factor experiment about extraction time，raito of liquid to material and extraction temperature，the extraction technology ofAmaranthusPaniculatusL.pigment was optimized by quadratic general rotary design and a quadratic regression equation was established. Also，effects of the factors were investigated by the equation.Results showed the pigment was one of the complex pigment，may contain flavonoids and chlorophyll.

Amaranthuspaniculatuspigments；preliminary qualitative；Quadratic General Rotary Design； extraction process optimization

国家自然科学基金项目(项目编号：31360378、31560428)；云南省自然科学基金项目(项目编号：2013FB042)；云南农业大学“国家大学生创新创业训练计划”项目(项目编号：201410676001、201510676001、201510676007)；云南省教育厅项目：云南省高校食品加工与安全控制重点试验室(项目编号：201401)。

张一鸣(1993— )，男，硕士，研究方向：功能性食品。

李永强(1975— )，男，博士，副教授，研究方向：食品科学。