胶体金免疫层析技术(GICA)在猪病检测中的应用研究进展

梁恒之

(建德市畜牧兽医局，浙江建德 311600)



胶体金免疫层析技术(GICA)在猪病检测中的应用研究进展

梁恒之

(建德市畜牧兽医局，浙江建德 311600)

胶体金免疫层析技术(GICA)是以胶体金为标记物，利用抗原抗体的特异性反应，对抗原(或抗体)物质进行定性、半定量乃至定量研究的免疫检测技术，是融合酶联免疫吸附、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术等多种技术，建立的一种新型体外快速诊断技术。

GICA的主要原理是以硝酸纤维素膜为载体，将胶体金标记物固定在金标塾上，其一端与膜相连，另一端与样品垫相连，将己知的特异性抗原或抗体固定于膜上的检测线。利用微孔膜的毛细管作用，使样品溶液(全血、血清、尿或其他体液)在层析条上泳动，若样品中含有待测物，则标记蛋白与待测物形成的复合物与检测线上的抗体(或抗原)发生特异性免疫反应，复合物被检测线捕获，出现肉眼可见的红色条带(T)；如样品中不含待测物，则会和游离标记物一起越过检测线，可被质控线截留，出现明显的红色条带(C)。因此，可以根据试纸条上检测线和质控线的显色情况判断样品溶液中是否含有待测物以及试纸条是否失效[1-2]。

GICA具有快速简便、灵敏、准确、稳定性强、成本低廉，通常数分钟内就可用肉眼直观判断检测结果等优点。

图1 胶体金免疫层析技术示意图

1 猪瘟病毒检测

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性的烈性传染病，对养猪生产的危害极大，多年来一直是我国猪病防治研究的首要对象之一。世界许多国家虽采取了许多措施较好地控制了猪瘟的大规模流行,但自20世纪70年代末以来猪瘟的流行与发病特点发生了很大变化,近年来猪瘟疫情又呈明显上升趋势,临床表现更为复杂。《猪瘟检疫技术规范》(GB/T16551)提供了兔体交叉免疫试验、免疫酶染色试验、病毒分离与增毒试验、直接免疫荧光抗体试验等实验室检测方法[2]，但上述方法对仪器设备和人员要求较高，且检测时间较长，不适用于屠宰检疫环节的现场检测要求。

王向鹏等(2010)[3]建立了检测猪瘟病毒(CSFV)野毒的胶体金免疫层析方法(GICA),该研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗CSFVE2蛋白的单克隆抗体(MAb)6E10作为捕捉抗体,将纯化的抗CSFVE2蛋白MAbHQ06和兔抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线(T)和质控线(C),优化反应条件,组装成胶体金免疫层析试纸条。该试纸条不与猪瘟兔化弱毒(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、伪狂犬病病毒(PrV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)产生反应。所制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性和重复性,初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的，检测效果良好。

杨明(2009)[4]建立了检测猪瘟病毒的胶体金免疫层析法(GICA)。该研究主要采用柠檬酸钠还原法制备胶体颗粒,用辛酸-硫酸铵盐析法纯化小鼠抗CSFV抗体,确定标记胶体金的最适pH值和抗体的最佳包被量,用胶体金标记抗体,且包被在玻璃纤维膜上,另将纯化的CSF抗体和羊抗鼠抗体包被在硝酸纤维膜上,组装成CSF快速检测试纸条,对猪瘟病毒进行检测。使用所研制的CSF快速检测试纸条阳性符合率达92.8%,且敏感性较高,用试制条对NDV、EDS-76病毒、TGEV、PRRSV等病毒进行快速检测,其结果无交叉反应，具有良好的特异性。

表1 两种猪瘟病毒快速检测方法比较

2 口蹄疫病毒检测

口蹄疫(FMD)是多种偶蹄动物共患的急性、热性、高度接触性传染病，是全球最重要的影响动物健康疫病之一，世界各地时有发生。该病传播媒介众多、速度快，是世界性流行性传染病之一。FMDV引发的病死率较低，但其感染率较高，被世界各国列为必须申报的动物疾病之一。目前，口蹄疫的检测技术主要有病毒分离技术、血清学检测技术和分子生物学技术等。病毒分离、补体结合试验(CFT)和病毒中和试验(VNT)等经典实验室方法，虽较为可靠准确，但试验步骤复杂，工作量大，花时长，需要采用活病毒，要求有特定的实验室以及熟练的操作人员，推广难度较大，ELISA PCR等方法虽特异性较好，灵敏度较高，但需配置专用仪器设备，因而检测费用较高[5]。

蒋韬等(2008)[6]建立了一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、AsiaI型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA)。研究采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、AsiaI型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China 99, A/AF72及AsiaⅠ/China 05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带(T)与质控带(C)。经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒。该试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度、较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原(SVD)、水泡性口炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒时无交叉反应，可检测病毒的最低含量为7.8×104LD50;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的检测符合率试验, O、A、AsiaⅠ型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%和100%，定型准确率94.58%。试剂盒在4℃下可保存6个月。

任维维等(2012)[7]将纯化的Asia 1/China 05流行毒株12S偶联抗原的兔抗体制备免疫胶体金,喷免疫胶体金于玻璃纤维制成金标垫，其建立的检测方法，在敏感度和阳性准确率方面有了进一步提高。且与猪水疱病抗原病毒(SVD)、水泡性口炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒无交叉反应，可检测到病毒的最低含量为0.98×104LD50，阳性样本的符合率为96.70%，阴性样本的符合率为100%(详见表2)。

3 猪繁殖与呼吸综合征病毒检测

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是一种新发现的接触性传染病，最早报道于20世纪80年代,患猪主要发生流产、早产、死胎、木乃伊胎和呼吸道等症状,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的母猪繁殖障碍以及仔猪呼吸系统症状和高死亡率的一种接触性传染病。我国将其列为二类传染病。《高致病性蓝耳病防治技术规范》(GB/T18090)中检测该病的方法为病毒分离鉴定和RT-PCR[8],实际生产中不适用于屠宰检疫环节的检测。

表2 两种口蹿疫病毒快速检测方法比较

陈一鸣(2011)[9]将纯化的PRRSV POP3株病毒蛋白和兔抗PRRSV IgG分别作为诊断试纸条的检测线(T线)和质控线(C线)包被于硝酸纤维素膜(NC膜)上,组装成快速检测试纸条。同时应用研制的PRRS抗体试纸条与ELISA检测方法分别对36份血清样品进行检测。结果显示PRRS抗体试纸条的敏感度为81.5%,特异度为100%,符合率为86.1%。

李雪松等(2011)[10]采用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金颗粒,标记抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体(MAb)2D7制备免疫检测探针,将抗PRRSV N蛋白的MAb 1G7和羊抗鼠IgG抗体印迹在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线(T)和质控线(C),经条件优化,组装成胶体金免疫层析试纸条。最低检测限度为103.0TCID50/mL;对猪场送检的150份病料样品进行PRRSV病原检测,与RT-PCR相比较,试纸条的特异性和敏感性分别为98.13%和88.37%，总符合率为95.33%。

牟林琳等(2014)[11]、周盛华(2004)[12]等所研制的胶体金检测试纸卡与胶体金免疫诊断试纸条，其检测的总符合率低于上述研究，与RT-PCR检测方法比较，符合率分别为93.3%和90.0%。

4 猪2型链球菌病原检测

猪2型链球菌病(SS2)是由多种链球菌引起的一种人兽共患的重要传染病，以脓肿为主要临床症状，引起患猪大脑炎、中耳炎、内膜炎、关节炎、肺炎或并发败血症，可对集约化养猪生产和从业人员健康造成重大危害。

胡玉山等(2013)[13]建立猪链球菌2型感染胶体金快速诊断方法。利用该试纸条对50份猪链球菌2型感染患猪血清样品和100份人血清样品进行检测，阳性和阴性检出率均达到100%，而ELISA 法的阳性符合率仅为98.0%。

5 猪支原体肺炎病原检测

猪肺炎支原体(Mhp)是引起猪支原体肺炎(MPS)的病原微生物。该病以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点,主要症状为咳嗽、气喘、饲料利用率降低,病猪生长缓慢,甚至成为僵猪,严重影响养猪生产的经济效益。

易兵(2010)[14]建立了猪肺炎支原体胶体金快速诊断方法，但该方法与ELISA方法相比，阳性检出率低了7个百分点，仅为83.8%。

6 旋毛虫病原检测

旋毛虫病是一种人兽共患的寄生虫病,由毛首目、毛形科的旋毛形线虫寄生所致。目前，国内用于猪旋毛虫病检测的方法，主要采用压片镜检法为主，检出率只有50%左右。

黄小燕等(2008)[15]利用河南某生物工程有限公司研制的金标试纸条对感染旋毛虫的仔猪进行检测，发现试纸条的检测结果较为准确可靠,且敏感性明显强于抗原试纸条，建议在检疫检验工作中使用抗体试纸条检测血清或肌肉样品。

任科研(2012)[16]所建立的旋毛虫胶体金快速诊断法，在敏感性、特异性、重复性等方面则与ELISA方法接近。

7 小结与讨论

据资料介绍，胶体金免疫层析技术已在动植物检疫、食品安全、医学等领域得到广泛推广应用，但目前在猪病及屠宰检疫检测中的应用，还存在以下问题。

一是临床应用方面。黄小燕等(2008)[15]的研究材料为旋毛虫商用试纸条，蒋韬等(2008)[6]的研究成果已在国家口蹄疫参考实验室应用，但其余研究成果是否已经产业化则尚无所知。

二是血样制备。需配备专用离心机分离血清，且需人员配合进行前腔静脉或耳缘静脉采血，耳缘静脉采血则相对比较方便。

三是正确率方面。与经典检测方法相比，检出符合率存在一定差距。但其优点在于快速、灵敏、成本低廉。

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[2] 编辑猪业科学. 猪瘟检疫技术规范[J]. 猪业科学. 2006, 23(3): 32-33.

[3] 王向鹏，孙元，杨增岐，等. 检测猪瘟病毒野毒株胶体金免疫层析方法的建立[J]. 中国预防兽医学报. 2010(06): 441-445.

[4] 杨明. 猪瘟C株单克隆抗体制备和猪瘟胶体金快速诊断试纸条的研制[D]. 甘肃农业大学, 2009.

[5] 蒋韬. 免疫层析技术在口蹄疫POCT中的应用研究[D]. 甘肃农业大学, 2012.

[6] 蒋韬，梁仲，陈涓，等. 口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立[J]. 中国农业科学. 2008(11): 3801-3808.

[7] 任维维，梁仲，智晓莹，等. 口蹄疫病毒通用型金标检测试纸条诊断方法的建立[J]. 畜牧兽医学报. 2012(02): 255-262.

[8] 中华人民共和国农业部. 高致病性蓝耳病防治技术规范[S]. 北京, 2007.

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[10] 李雪松，符芳，李海忠，等. 快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金免疫层析方法的建立[J]. 中国预防兽医学报. 2011(09): 718-722.

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[14] 易兵. 猪肺炎支原体免疫胶体金快速诊断试纸的研制[D]. 四川农业大学, 2010.

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[16] 任科研. 应用免疫胶体金技术对猪旋毛虫病诊断方法的研究[D]. 吉林大学, 2012.

2016-07-18

梁恒之(1988-)，男，湖南怀化人，硕士，主要研究方向为动物营养及动物检疫，E-mail：794858559@qq.com

S858.28

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1005-7307(2016)06-0011-004