过表达eNOS的MSCs移植抑制肺动脉高压大鼠NF-κB表达

赵科研，郭晓东，李红岩，佟昌慈，张玉彪，王辉山，侯明晓*

(沈阳军区总医院 1.心血管外科；2.急诊医学部，辽宁 沈阳110840)



*通讯作者

过表达eNOS的MSCs移植抑制肺动脉高压大鼠NF-κB表达

赵科研1，郭晓东1，李红岩1，佟昌慈2，张玉彪2，王辉山1，侯明晓2*

(沈阳军区总医院 1.心血管外科；2.急诊医学部，辽宁 沈阳110840)

目的 研究过表达eNOS的骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对肺动脉高压(PAH)大鼠的NF-κB影响。方法 构建过表达eNOS基因骨髓间充质干细胞；成年雄性Sprague Dawley大鼠，建立分流性PAH模型36只，每组12只， Shunt组；MSCs组；MSCs+eNOS 组，正常大鼠为Control 组。由中心静脉注入细胞，2周后进行测定血流动力学指标及肺组织病理变化，westernblot及荧光定量PCR测定肺组织表达NF-κB的变化。结果 MSCs移植能降低右心室收缩压，减轻肺病理改变， MSCs+eNOS组下降更明显。NF-κB的mRNA和蛋白表达在Shunt组表达最强，Control 组表达较弱，MSCs组、MSCs+eNOS 组较Shunt组明显降低，且MSCs+eNOS 组更显著。结论 MSCs和eNOS抑制高血流量PAH大鼠的NF-κB表达对高血流量的发挥治疗作用。

NF-κB；内皮型一氧化氮合成酶；分流性；动物模型； 肺动脉高压

(ChinJLabDiagn,2016,20:1827)

NF-κB是一种核转录因子，存在于真核生物体内，参与生物体内很多重要的生理反应[1]，NF-κB在肺动脉高压(PAH)的形成进程中扮演着重要的角色，在肺动脉血管重构中也发挥一定的生物学作用[2]。干细胞移植治疗的再生手段和基因治疗等研究不断应用于PAH的治疗，以打断PAH的恶性循环[3-5]，是研究的热点。采用骨髓间充质干细胞(MSCs)转染eNOS基因，移植肺动脉高压大鼠，NF-κB如何变化，我们进行如下研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验对象 成年雄性Sprague Dawley (SD)大鼠48只，体重150-200 g，周龄6周。购自沈阳军区总医院实验动物中心。

1.1.2 主要药品试剂与仪器 NOS-3(eNOS)抗体(Santa)，GAPDH(Santa)和NF-κB (Abcam)，RT-PCR试剂盒(大连宝生物Takara公司)，DNA 扩增仪(PT一200型)为美国PE公司产品，荧光定量PCR扩增仪(美国Applied Biosystems公司GeneAmp7300)。

1.2 方法

1.2.1 细胞准备 构建过表达eNOS(人类NOS3)慢病毒载体(上海吉凯公司)，含有GFP标记。慢病毒转染eNOS到SD大鼠MSCs(Cyagen公司)，第三代MSCs以0.25%的含EDTA的胰酶消化，PBS冲洗，1 000个细胞/μL浓度以PBS悬浮，置于冰上直到进行移植。

1.2.2 实验动物分组及细胞移植 采用左侧颈总动脉与左颈外静脉吻合分流[6]建立高血流肺动脉高压模型，12周后再次麻醉，每组12只：Shunt组；MSCs组；MSCs+eNOS 组；同一批正常大鼠12只做为Control 组。通过游离的右侧颈外静脉进行移植：MSCs组：1×106MSCs；MSCs+eNOS 组：1×106转染eNOS的MSCs ；Shunt组及Control 组：等容积PBS。缝合颈部切口，大鼠清醒后常规饲养。

1.2.3 系统血流动力学指标 右心微导管测右心室收缩压(RVSP)，压力波形经BL-420E系统记录并保存。

1.2.4 病理学检查 取大鼠的肺组织，置于10%中性福尔马林液中固定，经常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，经HE染色，光镜显微镜观察肺组织。分离心脏组织，测定右心室/(左心室+室间隔)质量比。

1.2.5 MSCs肺组织定位 细胞移植2周后，处死MSCs+eNOS 组大鼠时，取右上肺，在暗光下操作，采用OCT包埋，冰冻切片，采用多聚甲醛固定，DAPI 50 mg/L复染，甘油封片，荧光显微镜下观察GFP表达。

1.2.6 western blot 检测 提取肺组织蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭加入特异性一抗4°C杂交过夜，次日用1×TBST洗膜3次(10 min/次)，然后用1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温缓慢摇晃杂交2 h。l×TBST洗膜3次(10 min/次)。ECL(Bio-rad)发光，Western Blot成像系统采集图像。

1.2.7 荧光定量PCR 设计eNOS上游引物：5′- AGT GGC TGG TAC ATG AGC AC -3′，下游引物5′-GGT GAC TTT GGC TAG CTG GT-3′ ；NF-κB上游引物5′-CGG CCA TGG ACG AAC TGT TC-3′，下游引物5 ′-GAA CAG TTC GTC CAC ATG GCC CAC TTC -3′；GAPDH上游引物：5 ′- ACG GCA AGT TCA ACG GCA CAG -3′，下游引物：5′- GAC GCC AGT AGA CTC CAC GAC A -3′。提取总RNA，采用目的基因和内参基因进行荧光定量PCR反应，经逆转录反应，荧光定PCR法检测上述基因mRNA表达。

2 结果

2.1 MSCs的eNOS表达

细胞均呈长梭形生长，极性较好，生长速度较快，转染携带慢病毒后，可见细胞呈细胞浆绿色表达。移植2周后，肺脏中可见明显绿色荧光表达。

2.2 移植后病理变化

细胞移植2周后MSCs组RVSP明显下降，且转染eNOS的MSCs能进一步降低RVSP。Shunt组肺小动脉中膜增厚、管腔狭窄，炎症细胞增多，而MSCs组和MSCs+eNOS 组肺小动脉中膜增厚程度明显减轻。 心室体重比及右心室肥厚指数在MSCs组和MSCs+eNOS 组较分流组明显下降，转染eNOS基因未进一步减轻双心室的肥大。

2.3 NF-κB通路表达变化

荧光定量RT-PCR 和Westernblot 分析结果显示，细胞移植2周后，NF-κB的mRNA和蛋白表达在Shunt组表达最强，Control 组表达较弱，MSCs组、MSCs+eNOS 组较Shunt组明显降低，且MSCs+eNOS 组更显著(P<0.05)(图1)。

图1 细胞移植后NF-κB mRNA和蛋白表达变化

3 讨论

NF-κB最初由Sen等[1]在B淋巴细胞中发现，对体内的绝大多数细胞因子的产生、活化起调控作用，进而影响细胞功能，是凋亡、炎症及免疫反应等过程中的重要调节因子[7]。NF-κB参与生物体内很多重要的生理反应，该信号通路促进平滑肌细胞增殖、抑制调亡。

本实验发现，MSCs移植及联合eNOS移植均能够降低RVSP，改善肺组织小动脉内膜及中层厚度，增殖减缓，抑制了肺动脉高压的进展，具有明显的肺组织重构作用。结果显示NF-κB mRNA和蛋白表达水平在分流组明显最高，正常对照组低，实验组MSCs移植则明显降低，转染eNOS移植则进一步降低，说明移植后通过抑制NF-κB通路激活，参与体内基因的转录，从而抑制细胞的增殖，MSCs及eNOS通过调控NF-κB表达发挥作用。

[1]Sen R,Baltimore D.Inducibility of kappa immunoglobulin enhancer-binding protein NF-kappaB by a posttranslational mechanism[J].Cell,1986,47(6):921.

[2]Hosokawa S,Haraguchi G,Sasaki A,et al.Pathophysiological roles of nuclear factor kappaB (NF-kB) in pulmonary arterial hypertension:effects of synthetic selective NF-kB inhibitor IMD-0354[J].Cardiovasc Res,2013 ,99(1):35.

[3]Campbell AIM,Kuliszewski MA,and Stewart DJ.Cell-Based Gene Transfer to the Pulmonary Vasculature Endothelial Nitric Oxide Synthase Overexpression Inhibits Monocrotaline-Induced Pulmonary Hypertension[J].Am J Respir Cell Mol Biol,1999,21(5):567.

[4]Zhao Q,Liu Z,Wang Z,et al.Effect of Prepro-Calcitonin Gene-Related Peptide-Expressing Endothelial Progenitor Cells on Pulmonary Hypertension[J].Ann Thorac Surg,2007,84(2):544.

[5]Liu R,Wu S,Cao G,et al.Transfection of human hepatocyte growth factor gene inhibits advancing pulmonary arterial hypertension induced by shunt flow in a rabbit model[J].Transplant Proc,2013,45(2):705.

[6]ZHAO Ke-yan,WANG Hui-shan,SHANG Chang-qing,et al.Establishment model of new pattern and arteriovenous shunt of pulmonary artery hypertension in rats[J].Chin J Lab Diagn,2014,18(10):1586.

[7]Siebenlist U,Brown K,Claudio E.Control of lymphocyte development by nuclear factor-kappaB[J].Nat Rev Immunol,2005,5 (6):435.

Implantation of mesenchymal stem cells over-expressing eNOS prevents expression of NF-κB in rats with pulmonary arterial hypertension

ZHAOKe-yan,GUOXiao-dong,LIHong-yan，etal.

(DepartmentofCardiacSurgery,ShenyangNorthernHospital,Shenyang110840,China)

Objective To observe effects of mesenchymal stem cells (MSCs)over-expressing eNOS on NF-κB in rats with pulmonary artery hypertension (PAH).Methods MSCs were transfected by lentivirus expressing eNOS gene.Adult male Sprague Dawley rats were made as shunted PAH models,then were randomly divided into three groups:group shunt,group MSCs and goup MSCs+eNOS(n=12,respectively).The control group was matched normal rat.MSCs were injected through central vein.Two weeks later,hemodynamic index and lung biopsy were determined.Fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR)and Westernblot were used to determine the level of NF-κB.Results MSCs can reduce right ventricular systolic pressure and attenuated lung’s lesions.And it was more obviously in group MSCs+eNOS.The level of mRNA and protein of NF-κB was highest in group shunt,lower in group MSCs but lowest in group MSCs+eNOS.Conclusion MSCs and eNOS act on rats with high flow PAH by preventing the expression of NF-κB.

NF-κB;eNOS;shunt;animal model;pulmonary artery hypertension

1007-4287(2016)11-1827-03

R543.2

A

2016-03-18)