矿物药青礞石对PTZ点燃癫痫大鼠脑组织中氨基酸神经递质含量的影响

刘圣金，吴露婷，吴德康，王 瑞，喻 斌，王宇华，刘 培，杨文国

(1.南京中医药大学药学院，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学信息技术学院，江苏 南京 210023)



矿物药青礞石对PTZ点燃癫痫大鼠脑组织中氨基酸神经递质含量的影响

刘圣金1，吴露婷1，吴德康1，王 瑞1，喻 斌1，王宇华1，刘 培1，杨文国2

(1.南京中医药大学药学院，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023；2.南京中医药大学信息技术学院，江苏 南京 210023)

建立了超高效液相色谱-三重四极杆-线性离子阱质谱(Qtrap-UPLC-MS/MS)法同时测定大鼠脑组织中4种氨基酸类神经递质，研究了矿物药青礞石原药材粉末、水煎液、药渣对戊四氮(Pentylenetetrazol，PTZ)点燃癫痫模型大鼠脑组织中氨基酸类神经递质含量的影响。在ESI+电离模式下，采用多反应监测扫描方式测定脑组织(皮层，海马)中谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)及γ-氨基丁酸(GABA)的含量。结果表明：4种氨基酸的线性关系良好，精密度、准确度均符合生物样品的分析要求。大鼠给予青礞石不同样品后，脑组织皮层和海马中兴奋性神经递质Glu、Asp水平显著降低。与模型组相比，皮层中Gly占氨基酸总含量的百分比均增加，Asp/Gly值、Glu/Gly值均降低；海马中，各组Glu、Asp、Gly、GABA的浓度均降低。这说明，矿物药青礞石能有效降低PTZ点燃大鼠脑内兴奋性氨基酸递质含量，调节皮层和海马区Gly含量。

超高效液相色谱-三重四极杆-线性离子阱质谱(Qtrap-UPLC-MS/MS)；矿物药；青礞石；癫痫；氨基酸递质；海马；皮层

青礞石(Chloriti Lapis)为变质岩类黑云母片岩(Biotite Schist)或绿泥石化云母碳酸盐片岩(Mica Carbonate Schist by Chloritization)，是一种主要含K、Mg、Fe、Al等元素的硅酸盐[K(Mg·Fe)2(A1Si3O10)(OH, F)2]，其中Si、Fe、Mg、Al、Ca、K、Na等7种元素为主要成分，累积贡献率达到90.700%，此外尚含Ti、Mn、Zn、V、Co、Sn、Ni、P等多种元素[1-2]。青礞石是常用矿物药之一，性甘、咸、平，归肺、心、肝经，具有坠痰下气、平肝镇惊之功效[3]，临床上常用于治疗癫痫疾病。近年来，已有文献对青礞石的成分、质量控制、炮制工艺及药理作用等方面的研究进行了系列报道[2,4-6]。

癫痫是一种常见的神经系统疾病，癫痫的发生是由中枢神经系统兴奋与抑制间的不平衡导致的[7]。中枢神经系统的氨基酸递质分为兴奋性与抑制性两类。其中，谷氨酸(glutamic acid, Glu)和天冬氨酸(aspartic acid, Asp)是脑部重要的兴奋性神经递质；γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)，甘氨酸(glycine, Gly)是脑部重要的抑制性神经递质[8]。因氨基酸无紫外吸收，故多采用邻苯二醛(OPA)柱前衍生HPLC法结合荧光检测器或其改良法进行测定[9-10]，但该方法耗时长，且氨基酸荧光衍生产物不稳定。超高效液相色谱-三重四极杆-线性离子阱质谱法(Qtrap-UPLC-MS/MS)测定氨基酸具有对待测物分离要求低、用量少、操作简单、且无需衍生化处理等优点。

本研究拟采用Qtrap-UPLC-MS/MS法测定大鼠脑组织中4种氨基酸类神经递质，并对神经递质含量或比例变化进行检测，以期为探讨青礞石治疗癫痫的作用机制奠定基础。

1 实验部分

1.1 主要仪器与设备

Qtrap 5500 串联四极杆质谱仪：美国AB Sciex公司产品；LC-20AD XR型液相色谱仪：日本Shimadzu公司产品；Bioprep-24生物样品均质仪：杭州奥盛仪器公司产品；AllegraTMX-22R型冷冻离心机：德国BeckMan公司产品；MDF-U32V(N)型超低温保存箱：日本SANYO公司产品；KQ-500型超声仪：昆山市超声仪器有限公司产品；JE2002型电子天平：上海浦春计量仪器有限公司产品；MS105DU型十万分之一电子天平：梅特勒托利多仪器(上海)有限公司产品。

1.2 样品与试剂

青礞石药材(批号：20140412)：由亳州矿石专营店提供，经南京大学地球科学与工程学院孔庆友教授鉴定为黑云母片岩Biotite Schist；卡马西平片(国药准字H11022279)：北京诺华制药有限公司产品；戊四氮(批号1001603974)，γ-氨基丁酸(GABA)：美国Sigma 公司产品；谷氨酸(Glu)：Camycal公司产品；甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)：美国Amresco公司产品；乙腈(质谱纯)：德国Merck公司产品；对照品含量均不小于99%；水为超纯水；其他试药均为市售分析纯。

1.3 实验动物

清洁级雄性SD大鼠：由上海杰思捷实验动物有限公司提供，合格证编号：2010002600592，共90只，体重150～170 g。购回大鼠后，在适宜条件下适应性喂养一周，自由饮食。

1.4 动物模型的建立

PTZ点燃癫痫大鼠模型的制备[11-13]：用生理盐水将PTZ配制成1 g/100 mL溶液[14]，每日固定时间给大鼠腹腔注射PTZ溶液，剂量按亚致痉量35.0 mg/kg[15]标准进行造模，持续4周；停药1周后，再用相同剂量PTZ测试，凡显示连续5次Ⅱ级或Ⅱ级以上惊厥的大鼠被认为达到了点燃标准[16]。采用Racine[17]标准对大鼠癫痫性发作进行分级：0级为无抽搐发作；Ⅰ级为面部抽搐和孤立性肌痉挛；Ⅱ级为全身性痉挛抽搐；Ⅲ级为全身性痉挛呈无明显间歇的癫痫持续状态或抽搐致死；Ⅳ级为全身性强直痉挛抽搐，伴站立和跌倒；Ⅴ级为同Ⅳ级反复发作呈无明显间歇的癫痫持续状态或抽搐致死。其中，大鼠若出现持续 V 级发作，需给予1 mL 7%水合氯醛缓解发作。

1.5 给药样品的制备

青礞石原药材样品的制备：将青礞石药材在玛瑙研钵中磨成细粉后过药典6号筛，用PEG400[18]调匀，使每10 mL PEG400中含5 g青礞石粉。

青礞石水提液样品的制备：取青礞石药材置于煎煮容器内，第一次加入10倍量水，煮沸1.5 h后用纱布过滤，所得药液为头煎药液；向过滤后的药渣中加入8倍量水继续加热，煮沸1 h后用纱布过滤，所得药液为二煎药液；将两次煎药液合并，浓缩至每10 mL药液相当于5 g生药，即为低剂量水煎液，浓缩至每5 mL药液相当于5 g生药，即为高剂量水煎液。

青礞药渣样品的制备：将水煎后的青礞石药渣烘干，采用与青礞石原药材相同的制备方法制得药渣样品。

阳性药卡马西平样品的制备：用生理盐水配制每100 mL 含2 g卡马西平的溶液。

1.6 分组及给药

将生理盐水处理过的大鼠作为空白对照组(CG)；造模成功的大鼠随机平均分为8组，即卡马西平组(PG)、原药材高剂量组(PH)、原药材低剂量组(PL)、药渣高剂量组(RH)、药渣低剂量组(RL)、药液高剂量组(WH)、药液低剂量组(WL)、模型对照组(MG)。按照人和动物体表面积折算等效剂量，CG、PG、PH、PL、RH、RL、WH、WL和MG组分别予以5、5、4、1、4、1、5、2.5、5 mL/kg灌胃。连续灌胃给药4周，每周称量2次体重，并根据体重调整用药剂量。

1.7 实验条件

1.7.1 色谱条件 色谱柱：XBridge Amide(2.1 mm×50 mm×3.5 μm)；流动相：A相为乙腈，B相为6 mmol/L乙酸铵(含0.1%冰醋酸)；梯度洗脱程序：0～3 min、98%B，3～6 min、98%～85%B，6～9 min、85%～70%B，9～12 min、70%～50%B，12～13 min、50%～98%B，13～15 min、98%B；柱温40 ℃；流速0.8 mL/min；检测波长254 nm；进样量1 μL。

1.7.2 质谱条件 Turbo Spray离子源，ESI+电离模式，多反应监测(MRM)采集方式，离子化温度550 ℃，喷雾电压5 500 V，雾化气(GS1)流速55 L/min，辅助气(GS2)流速55 L/min，气帘气流速35 L/min。用于定量的离子分别为：Glu母离子m/z148，子离子m/z84；Gly母离子m/z76，子离子m/z30；Asp母离子m/z134，子离子m/z74；GABA母离子m/z104，子离子m/z8。

1.7.3 标准储备液的配制 取4种氨基酸对照品各100 mg，精密称定，分别置于100 mL容量瓶中，用纯水溶解并稀释至刻度，得4种氨基酸标准品储备液。

1.7.4 标准曲线及线性范围 取不同体积的各氨基酸标准储备液，用超纯水稀释并定容至10 mL容量瓶中，得一系列浓度梯度的混合对照品溶液，详情列于表1。以峰面积y对浓度x(mg/L)进行线性回归，结果列于表2。

表1 不同浓度梯度的氨基酸标准品在10 mL容量瓶中的加入量

表2 各种氨基酸的标准曲线及线性范围

1.7.5 海马、皮层样品的处理 大鼠冰上断头取脑，分离皮层及海马，在冷生理盐水(4 ℃)中洗去血液，用滤纸吸干水分，称其质量；按料液比1∶9加入0.4 mol/L高氯酸沉淀蛋白，匀浆机匀浆，彻底混匀组织液；以12 000 r/min低温离心15 min，取上清液，于-80 ℃冰箱保存，待测。测定前用稀氨水调至pH中性，过0.45 μm微孔滤膜。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性实验 精密量取1.7.3节配制的标准品储备液适量，制成适当浓度的混标溶液，在1.7.1和1.7.2节条件下检测，并与脑组织样本的色谱图进行比较，结果示于图1。可见，各色谱峰的保留时间在7～8 min之间，无杂质干扰，峰型良好。

2.1.2 精密度实验 日内精密度：取同一混合对照品溶液，于同一天不同时间段每隔2 h进样1次，连续进样6次，计算得Glu、Asp、Gly和GABA峰面积的RSD分别为3.29%、3.25%、2.88%、2.41%。

日间精密度：取同一混合对照品溶液，于第1、2、3、4、5天分别进样，计算得Glu、Asp、Glyp和GABA峰面积的RSD分别为3.19%、2.63%、3.04%、2.25%。

2.1.3 准确度实验 取同一组织匀浆，按1.7.5节条件处理脑样品，平行制备5份样品，进行LC-MS/MS分析，计算得皮层样品和海马样品的Glu、Asp、Gly、GABA峰面积的RSD分别为1.47%、1.61%、3.47%、2.39%和4.36%、1.87%、2.11%、3.14%，均符合生物样品的分析要求。

2.1.4 稳定性实验 取2.1.2节配制的同一混合对照品溶液，于4 ℃保存，分别在0、6、12、24 h进样分析。结果表明，在4 ℃条件下，样品在24 h内稳定性较好。取1.7.5节的皮层及海马样品各3份，于-80 ℃保存，每3周测定1份，比较各种氨基酸在不同时间点的含量变化。结果表明，保存于-80 ℃的样品较稳定，在2个月内无明显降解。

2.2 数据处理与分析

注：A.对照品；B.皮层样品；C.海马样品；1.Glu；2.Gly；3.Asp；4.GABA

2.2.2 测定结果 在皮层中，与MG组比较，其他各组Gly含量占总氨基酸含量的比例明显升高，其中CG和PG组具有极显著性差异(P<0.01)，RH、RL组具有显著性差异(P<0.05)；Asp/GLy含量明显降低，其中CG、PG及PH组具有极显著性差异(P<0.01)，RL、WH和WL组具有显著性差异(P<0.05)；Glu/GLy含量明显降低，其中CG、PG、RH和RL组具有极显著性差异(P<0.01)，WH组具有显著性差异(P<0.05)；PH和PL组具有明显的量效关系，结果列于表3。

在海马中，与MG组比较，其他各组Glu浓度均降低，其中RH、RL、WH和WL组具有极显著差异(P<0.01)；Asp浓度均降低，其中PG组具有极显著差异(P<0.01)，CG、PH、RH和RL具有显著性差异(P<0.05)；Gly浓度均降低，其中CG、PG、PH和RL组具有极显著差异(P<0.01)，RH和WH组具有显著性差异(P<0.05)；GABA浓度均降低，其中CG、PG、PH、PL、RH、RL和WL组具有极显著差异(P<0.01)，WH组具有显著性差异(P<0.05)；PH组对Asp、Gly、GABA的干预作用最强；PH和PL组具有明显的量效关系，结果列于表4。

表3 皮层中，Gly、Asp/Gly和Glu/Gly水平

注： #表示Gly占氨基酸总含量的百分比； *表示P<0.05；**表示P<0.01

表4 海马中，Glu、Asp、Gly及GABA含量

注： *表示P<0.05；**表示P<0.01

2.3 讨论

2.3.1 供试品制备方法的优化 选取甲醇、乙腈、高氯酸这3种蛋白沉淀剂进行比较，结果表明，高氯酸的沉淀能力较强。实验对匀浆浓度(1∶4、1∶9和1∶19)进行了比较，结果显示，在1∶9时响应值最好，但色谱峰有分岔现象。考虑到可能由于高氯酸的酸性过强，因此采用稀氨水调至pH中性，最终获得了理想的峰型。2.3.2 色谱-质谱条件的优化 XBridge Amide分析柱可用于极性物质的保留分析，耐受性较好，可取代硅胶氨基柱，能从根本上解决氨基键合硅胶柱不耐高pH值和键合相流失严重的问题，其性能大大优于传统的硅胶基质氨基柱，且3.5 μm粒径能提升柱效与分辨率。实验选择了信噪比较低的正离子模式，同时对质谱参数中的母离子、子离子进行摸索，对裂解能量和碰撞能量进行优化。

2.3.3 给药样品的选择 为了考察不同给药样品的有效性和临床上水煎后废弃的药渣是否仍具有药效，以充分利用青礞石资源，本实验设有粉末组、水煎液组及药渣组。若粉末组最有效，水煎液组次之，药渣组效果最不明显，则说明青礞石的有效成分可通过水煎液煎出；若粉末组最有效，药渣组次之，水煎液组效果最不明显，则说明青礞石的有效成分不可通过水煎液煎出。

2.3.4 实验结果分析 GABA通过Glu脱羧而成，经GABA转运体转运至胞内而降解；Gly主要分布于中间神经元，在中枢神经系统的某些区域，Gly与GABA呈同步性释放；而Asp与Glu同为兴奋性神经递质。文献[19-20]报道了通过Glu/GABA值及Glu/Gly值考察兴奋性与抑制性神经递质在脑内的平衡关系，但鲜有Asp/Gly值的报道。本实验中，青礞石能够降低癫痫大鼠海马中兴奋性氨基酸递质Glu和Asp的含量，各组样品均能提高癫痫大鼠皮层抑制性神经递质Gly的比例，降低Asp/Gly值和Glu/Gly值。兴奋性氨基酸含量的降低，说明青礞石可以通过降低脑内兴奋性神经递质的毒性作用[21]来保护神经元，从而抑制癫痫发作。对于皮层中Gly含量升高、海马中Gly和GABA含量降低的现象，可能有以下原因：1) 虽然Gly通常被认为是抑制性神经递质[22-24]，但也有文献[25-26]认为它是兴奋性神经递质，由此猜想，Gly在皮层中可能作为抑制性神经递质，而在海马中却作为兴奋性神经递质存在；2) Gly在皮层和海马中给药后的含量变化相反，这可能与皮层和海马的不同功能定位有关[27]；3) 青礞石降低了癫痫大鼠海马GABA的含量，可能与癫痫发生后的体内代偿反应有关，这一现象与文献[28-29]的结果一致。

3 结论

本研究建立了Qtrap-UPLC-MS/MS同时测定4种氨基酸神经递质的方法，分析了青礞石对戊四氮点燃癫痫大鼠脑组织(海马、皮层)中氨基酸递质含量的影响。结果表明：青礞石药材组、药液组及药渣组对抑制癫痫均有效。由此推测：青礞石抗癫痫作用机制是在降低兴奋性神经递质含量的同时，又提高了抑制性神经递质在脑内的含量。通过减少兴奋性神经递质对神经组织的兴奋毒性作用，维持了脑内兴奋性与抑制性氨基酸之间的平衡关系，抑制了异常放电，从而达到抗癫痫的作用。本研究可为矿物药青礞石治疗癫痫疾病的作用机制提供参考。

[1] 刘圣金，吴德康，刘训红，等. 青礞石的本草考证及现代研究[J]. 中国实验方剂学杂志， 2011, 17(12): 260-263.

LIU Shengjin, WU Dekang, LIU Xunhong, et al. Textual reseach and modern study on Chinese mineral drug Chloriti Lapis[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2011, 17(12): 260-263(in Chinese).

[2] 刘圣金，吴德康，林瑞超，等. 矿物药青礞石无机元素的ICP-MS分析[J]. 药物分析杂志，2010,30(11):2 067-2 074.

LIU Shengjin, WU Dekang, LIN Ruichao, et al. ICP-MS analytical studies on inorganic elements of mineral Chinese medicine Chloriti Lapis[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2010, 30(11) : 2 067-2 074(in Chinese).

[3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015.

[4] 刘圣金，吴德康，林瑞超，等. 青礞石的炮制工艺研究[J]. 中草药，2012,43(8):1 508-1 513.

LIU Shengjin, WU Dekang, LIN Ruichao, et al. Studies on processing technology of Chloriti Lapis[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2012, 43(8): 1 508-1 513(in Chinese).

[5] 刘圣金，吴德康，刘训红，等. 青礞石的药理作用及临床研究进展[J]. 中国中医药信息杂志，2010,17(10):109-112.

LIU Shengjin, WU Dekang, LIU Xunhong, et al. Progress on pharmacological effects and clinical research of Chloriti Lapis[J]. Chinese Journal of Informaton on Traditional Chinese Medicine, 2010, 17(10): 109-112(in Chinese).

[6] 刘圣金，吴德康，林瑞超，等. 青礞石药材质量标准研究[J]. 中药材，2011,34(10):1 532-1 534.

LIU Shengjin, WU Dekang, LIN Ruichao, et al. Quality standards of Chloriti Lapis[J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2011, 34(10): 1 532-1 534(in Chinese).

[7] YU Y H, XIE W, WANG C J. Chaihushugan decoction exerts antiepileptic effects by increasing hippocampal glutamate metabolism in pentylenetetrazole-kindled rats[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine, 2015, 35(6): 659-665.

[8] 陈燕，王有志，安春志，等. LC-ESI-MS/MS测定大鼠海马和纹状体中氨基酸类神经递质的含量[J]. 今日药学，2013,23(2):65-69.

CHEN Yan, WANG Youzhi, AN Chunzhi, et al. Simultaneous determination of neurotransmitter amino acids in rat hippocampus and corpus striatum by LC-ESI-MS/MS[J]. Pharmacy Today, 2013, 23(2): 65-69(in Chinese).

[9] 俞军龄，陈再兴，毛小元，等. HPLC法测定tremor大鼠脑组织中谷氨酸和GABA含量[J]. 中国药理学通报，2009,25(11):1 530-1 533.

YU Junling, CHEN Zaixing, MAO Xiaoyuan, et al. Determination of glutamate and GABA in tremor rat by HPLC[J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2009, 25(11): 1 530-1 533(in Chinese).

[10]吴强恩，郑力行，谢芳，等. 反相高效液相色谱荧光法测定大鼠脑组织中氨基酸类神经递质[J]. 复旦学报：医学版，2005,32(3):355-358.

WU Qiang′en, ZHENG Lixing, XIE Fang, et al. Determination of the amino acids in rat brain by high-performance liquid chromatography and fluorescence detection[J]. Fudan University Journal Medical Sciences, 2005, 32(3): 355-358(in Chinese).

[11]孟喜君，王峰，李传坤. 白藜芦醇对戊四氮致痫大鼠的学习记忆能力的影响[J]. 中华神经外科疾病研究杂志，2013,12(3):227-231.

MENG Xijun, WANG Feng, LI Chuankun. Effects of resveratrol on learning and memory ability of pentylenetetrazole-kindled rats[J]. Chinese Journal of Neurosurgical Disease Research, 2013, 12(3): 227-231(in Chinese).

[12]徐国龙，杨帆，章复清，等. 柴胡加龙骨牡蛎汤对PTZ点燃型癫痫大鼠脑内氨基酸含量的影响[J]. 中国医药学报，2002,17(3):165-167.

XU Guolong, YANG Fan, ZHANG Fuqing, et al. Efect of Chaihu Plus Longgumuli Decoction on the brain amino-acid amount of PTZ-ignited epileptic rat[J]. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 2002, 17(3): 165-167(in Chinese).

[13]王艺，李智平，施忆贇. 戊四氮点燃大鼠慢性癫痫模型的建立及评价[J]. 复旦学报：医学版，2006,33(2):206-208,228.

WANG Yi, LI Zhiping, SHI Yiyun. The establishment and appraisement of pentylenetetrazol-induced kindling in rats[J]. Fudan University Journal Medical Sciences, 2006, 33(2): 206-208, 228(in Chinese).

[14]LI Z P, ZHANG X Y, LU X, et al. Dynamic release of amino acid transmitters induced by valproate in PTZ-kindled epileptic rat hippocampus[J]. Neurochemistry International, 2004, 44(4): 263-270.

[15]AKSOY D, SOLMAZ V, ERBAS O. Positive effect of calcitonin on the seizures induced by pentylenetetrazole in rats[J]. Epilepsy Research, 2014, 108(3): 390-395.

[16]慕宝龙，田茸，舍雅莉，等. 平痫颗粒对癫痫大鼠海马神经元细胞凋亡及基因表达的影响[J]. 中国中医药信息杂志，2012,19(6):35-37.

MU Baolong, TIAN Rong, SHE Yali, et al. Effects of Pingxian particle on cell apoptosis of hippocampal neurons and its gene expression in epileptic rat model[J]. Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine, 2012, 19(6): 35-37(in Chinese).

[17]SAHU S, DUTTA G, MANDAL N, et al. Anticonvulsant effect ofMarsileaquadrifoliaLinn. on pentylenetetrazole induced seizure: A behavioral and EEG study in rats[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2012, 141(1): 537-541.

[18]韩琳，汤道权，印晓星，等.α-细辛脑的抗惊厥、抗癫痫作用及其机制研究[J]. 中国药理学通报，2009,25(7):963-966.

HAN Lin, TANG Daoquan, YIN Xiaoxing, et al. Research oil anticonvulsive and antiepileptic effect of alpha-asarone and its mechanism[J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2009, 25(7): 963-966(in Chinese).

[19]白宝丰，王斌，张蕴琨. 力竭运动前后大鼠脑皮质运动区递质性氨基酸含量的动态变化[J]. 南京体育学院学报：自然科学版， 2008,7(3):1-5.

BAI Baofeng, WANG Bin, ZHANG Yunkun. Changes of amino acids neurotransmitter concentration in motor area of rats cortex induced by acute exhaustion treadmill running[J]. Journal of Nanjing Institute of Physical Education: Natural Science, 2008, 7(3): 1-5(in Chinese).

[20]李敏，孔德虎，许奇，等. 颞叶癫痫大鼠不同时期海马和皮层氨基酸类递质的变化[J]. 安徽医科大学学报，2010,45(2):135-138.

LI Min, KONG Dehu, XU Qi, et al. Changes of amino acid neurotransmitters in temporal lobe epilepsy rats' hippocampus and cortex during different periods[J]. Acta Universitatis Medicinalis Anhui, 2010, 45(2): 135-138(in Chinese).

[21]PATSOUKIS N, ZERVOUDAKIS G, GEORGIOU C D, et al. Effect of pentylenetetrazol-induced epileptic seizure on thiol redox state in the mouse cerebral cortex[J]. Epilepsy Research, 2004, 62(1): 65-74.

[22]唐洪梅，席萍，吴敏，等. 石菖蒲对小鼠脑组织氨基酸类神经递质的影响[J]. 中药新药与临床药理，2004,15(5):310-311.

TANG Hongmei, XI Ping, WU Min, et al. Effects ofRhizomaAcoriTatarinowiion amino acids neurotransmitter in mice brain[J]. Traditional Chinese Drug Research & Clinical Pharmacology, 2004, 15(5): 310-311(in Chinese).

[23]周磊，杨文明，孙林娟. 智脑胶囊对实验性阿尔茨海默病模型大鼠脑组织氨基酸含量的影响[J]. 中医药临床杂志，2010,22(11):1 007-1 009.

ZHOU Lei, YANG Wenming, SUN Linjuan. Effects of Zhinao capsule on amino acid content of Alzheimer's disease rat brain[J]. Clinical Journal of Traditional Chinese Medicine, 2010, 22(11): 1 007-1 009(in Chinese).

[24]王净净，黄雁，何群，等. 愈痫灵对慢性致痫大鼠海马区氨基酸含量的影响[J]. 湖南中医学院学报，2004,24(6):8-11.

WANG Jingjing, HUANG Yan, HE Qun, et al. The effects of Yuxianling Granule on the content of amino acid in hippocampus of rats with chronic epilepsia induced by pentylenetetrazol injection[J]. Journal of Traditional Chinese Medicine University of Hunan, 2004, 24(6): 8-11(in Chinese).

[25]梁树立，李安民，黎君友，等. X线照射对实验性癫痫大鼠脑皮层氨基酸递质含量的影响[J]. 解放军医学杂志，2005,30(5):408-409.

LIANG Shuli, LI Anmin, LI Junyou, et al. Effect of X-ray on amino acid transmitters in brain of epileptic rat[J]. Medical Journal of Chinese People's Liberation Army, 2005, 30(5): 408-409(in Chinese).

[26]谭来勋，孙圣刚，王细林，等. 发育期大鼠海马氨基酸类神经递质的研究[J]. 卒中与神经疾病，2005,(2):100-102.

TAN Laixun, SUN Shenggang, WANG Xilin, et al. The amino acid neurotransmitters of the hippocampus in rats[J]. Stroke and Nervous Disease, 2005, (2): 100-102(in Chinese).

[27]方若鸣，方更利，柯雪红，等. 安脑片对慢性点燃癫痫大鼠脑内氨基酸递质的影响[J]. 中华中医药学刊，2007,25(11):2 388-2 390.

FANG Ruoming, FANG Gengli, KE Xuehong, et al. Effects of Annao tablet on amino acid neurotransmitter in kindling epilepsy rats brain[J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine, 2007, 25(11): 2 388-2 390(in Chinese).

[28]班婷婷，吴强恩，姜楠，等. 乐果急性染毒对大鼠海马抑制性氨基酸神经递质的影响[J]. 复旦学报：医学版，2007,34(1):12-16.

BAN Tingting, WU Qiang′en, JIANG Nan, et al. Acute effects of dimethoate on inhibitory amino acid neurotransmitters in rat hippocampus[J]. Fudan University Journal of Medical Sciences, 2007, 34(1): 12-16(in Chinese).

[29]方永奇，方若鸣，方更利，等.β-细辛醚对癫痫大鼠脑皮质Glu、GABA、GAD的影响[J]. 中国药房，2007,18(27):2 097-2 098.

FANG Yongqi, FANG Ruoming, FANG Gengli, et al. Effects ofβ-Asarone on glutamic acid, gamma-aminobutyric acid, glutamate decarboxylase in epileptic rats brain cortex[J]. China Pharmacy, 2007, 18(27): 2 097-2 098(in Chinese).

Effect of Mineral Chinese Medicine Chloriti Lapis on Amino Acid Content in Brain Tissues of Pentylenetetrazol-Kindled Epileptic Rats

LIU Sheng-jin1, WU Lu-ting1, WU De-kang1, WANG Rui1, YU Bin1,WANG Yu-hua1, LIU Pei1, YANG Wen-guo2

(1.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization,SchoolofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China；2.InformationTechnologyCollege,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

The method of Qtrap-ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (Qtrap-UPLC-MS/MS) was established for simultaneous determination four amino acid neurotransmitters in rat’s brain tissue. The effects of powder, water decoction and dregs of Chloriti Lapis on amino acid content in PTZ-kindled epileptic rat’s brain tissue were studied. The contents of Glu, Gly, Asp and GABA in rat’s brain tissue (cortex and hippocampus) were detected by multiple reactions monitoring (MRM) scan mode in positive electrospray ionization (ESI+). The result shows that the four amino acids have good linear relationship, the RSDs of precision and accuracy conform to the requirements of analysis in biological samples. After rats were treated with different samples of Chloriti Lapis, excitatory neurotransmitter Glu, Asp in cerebral cortex and hippocampus decreased significantly. Compared with the model group, the content of Gly in cerebral cortex is increased in the percentage of total amino acidcontents, while the ratio of Asp/Gly and Glu/Gly are decreased. The contents of Glu, Asp, Gly and GABA in other groups display reduction in hippocampus compared with the model group. This shows that mineral Chinese medicine Chloriti Lapis can effectively reduce the excitatory amino acid contents in PTZ-kindled rat’s brain, and effectively regulate the content of Gly in the cortex and hippocampus.

Qtrap-ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (Qtrap-UPLC-MS/MS); mineral Chinese medicine; Chloriti Lapis; epilepsy; amino acid neurotransmitters; hippocampus; cortex

2016-02-24;

2016-05-09

国家自然科学基金项目(81303178)；江苏省自然基金项目(BK20130957)；江苏省高校优势学科建设工程资助项目(二期)；江苏高校品牌专业建设工程项目(PPZY2015A070)资助

刘圣金(1978—)，男(汉族)，安徽金寨人，讲师，从事中药鉴定及质量标准和矿物药研究。 E-mail: 13770653305@139.com

吴德康(1951—)，男(汉族)，江苏宜兴人，教授，从事中药鉴定及质量标准和矿物药研究。E-mail: wudekang2008@126.com

时间：2016-09-01；

http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160901.1515.006.html

O657.63

A

1004-2997(2016)06-0533-09

10.7538/zpxb.youxian.2016.0040