三氯乙烯药疹样皮炎患者血清miRNAs差异表达谱分析

郑 剑，蓝 涛，刘 威，邓荣霞，李培茂，张艳芳，刘建军，*

（1.湖 南师范大学医学院预防医学系，湖南 长沙 410013；2.深 圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518055；3.深圳市职业病防治院，广东 深圳 518001）

三氯乙烯药疹样皮炎患者血清miRNAs差异表达谱分析

郑 剑1，2，蓝 涛2，刘 威2，邓荣霞2，李培茂3，张艳芳3，刘建军1，2，*

（1.湖 南师范大学医学院预防医学系，湖南 长沙 410013；2.深 圳市疾病预防控制中心，广东 深圳 518055；3.深圳市职业病防治院，广东 深圳 518001）

约为20～24个核苷酸，通过与其靶基因结合，调控靶基因的转录或翻译，以往研究发现，miRNA在细胞的增殖、分化、凋亡和疾病发生发展中发挥重要作用。miRNA调控人体内1/3的基因表达，许多疾病的发生发展与miRNA密切相关[2]。大量研究表明miRNA可作为新的分子标志物，但有关OMLDT的miRNA研究尚未见报道。因此，本研究利用基因芯片技术，筛选OMLDT与TCE接触者血清之间的差异表达miRNA，为进一步验证OMLDT生物标志物和阐明miRNA在OMLDT发生和发展中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2009年1月1日—2014年12月30日入住深圳市职业病防治院的OMLDT病例34例，对照组34例。病例组入选标准严格按照国家诊断标准《职业性三氯乙烯药疹样皮炎诊断标准》[3]执行。对照组入选标准为明确的TCE接触史，体检合格，均排除艾滋病、心血管、肝脏、肾脏及糖尿病等疾病。年龄、性别、居住环境等与病例组相匹配。miRNA芯片筛查选取其中5位OMLDT患者和5位对照人群的血清。实时荧光定量PCR(qPCR)验证采用34位OMLDT患者和34位对照人群的血清。

1.2 血清收集

干燥真空管采集全血(6mL)，室温下放置20～30min，4℃、2 000 g离心10min，收集血清，于-80℃保存待用。

1.3 总RNA抽提和质量检测

根据miRNeasy Serum/Plasma Kit(德国Qiagen公司)试剂盒说明书步骤，提取血清中总RNA，使用NanoDrop 2000c测定RNA的纯度和浓度。

严肃党内政治生活是加强党的自身建设的基础性工作，要把我们党建设成为始终走在时代前列、人民衷心拥护、勇于自我革命、经得起各种风浪考验、朝气蓬勃的马克思主义执政党，就必须把严肃党内政治生活这一基础性工作做好。习近平同志站在保持党的马克思主义政党性质、更好担负历史使命、全面加强自身建设和形成良好党内政治生态的战略高度，对严肃党内政治生活的应有作用给予充分肯定。

1.4 荧光探针的制备、标记和芯片杂交

采用miRCURY LNATMARRAY Power标记试剂盒(丹麦Exiqon公司)，用标记酶将Hy3TM荧光基团标记miRNA，得到杂交探针，在标准条件下使用MAUI杂交仪将标记好的探针和miRCURY LNATM芯片杂交。

1.5 qPCR验证

按照miScriptⅡRT Kit试剂盒(德国Qiagen公司)说明书步骤进行逆转录，反应条件为16℃、30min，42℃、40min，85℃、5min。按照miScript SYBR Green Kit(德国Qiagen公司)试剂盒说明书步骤进行PCR扩增，反应条件：95℃预变性10min；95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s，40个PCR循环。引物序列见表1。以miR-93-5p为内参，数据采用2-△△CT法进行分析。

表1 引物序列表

1.6 数据分析

使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片荧光强度，使用GenePix Pro V6.0软件将所得数据转化成数字信息，通过配对t检验进行差异基因表达的分析。使用软件MeV 4.0对数据进行聚类分析。

1.7 靶基因预测

使用miRWalk 2.0(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/ zmf/mirwalk2/index.html)对筛选出具有显著差异的miRNAs进行miRNA靶基因的预测，并将预测结果与miRanda、miRDB、RNA22、Target Scan软件预测的结果进行对比，找出几个数据库中这些miRNA共同的靶基因。

2 结果

2.1 一般资料

实验组男性22名，女性12名，对照组男性21名，女性13名，两组间差异无统计学意义(χ2=0.63，P= 0.80)；实验组平均年龄(26.74±9.61)岁，对照组平均年龄(26.29±6.11)岁，两组间差异无统计学意义(t= 0.226，P= 0.82)。

2.2 病例组miRNA差异表达及聚类图

在5位OMLDT患者(病例组)和5位对照人群(对照组)血清样本中，提取出的总RNA D(280)/D(260)比值均在1.8～2.0之间，RNA质量较好，能满足miRNA芯片检测要求。与对照组相比，病例组血清中共有69个差异表达miRNAs，其中高表达39个，低表达30个。应用聚类分析方法，将差异表达的69个miRNA芯片数据导入MeV 4.0软件，得到聚类图(图1)。应用MiRanda分析软件，搜索与OMLDT的信息，选择与OMLDT有关的miR-199b-5p进行进一步验证。

图1 差异表达miRNA的聚类图

2.3 qPCR验证结果

实时荧光定量PCR检测结果显示(图2)，miR-199b-5p在OMLDT中高表达(P<0.05)。

图2 qPCR检测miR-199b-5p的相对表达

2.4 差异表达miRNAs的火山图

火山图将不同组之间差异表达的miRNAs进行图形化的展示，X轴表示miRNAs表达倍数的变化(log2转换)，Y轴表示对应的P值(-lg转换)，如图3。红色表示差异具有统计学意义，且差异倍数>2倍。通过分析，共有22个显著差异表达的miRNAs。

图3 差异表达miRNAs的火山图

2.5 靶基因预测

通过miRWalk 2.0对筛选出来差异显著的22个miRNA进行靶基因预测，并将预测结果与其他软件的预测结果进行比较，只有miR-409-3p和miR-485-3p在 5个数据库中都预测到了共同的靶基因，预测结果显示miR-409-3p的靶基因是APOBEC2、CTNND1、CNTN4、ABCA13、SPRED1、GAB1、VPS41、COMMD9、 ITGB3、TAL1、MRP63、MOBKL1A、

ZNF614、MAP4K3。miR-485-3p的靶基因是GABRA4、MEOX2、NFYB、UBA6、LOC400120、GNAI1。

3 讨 论

三氯乙烯是一种常见的有机溶剂和环境污染物。近年来国内外因职业接触而引起的TCE中毒事件屡见报道，其中以职业性三氯乙烯药疹样皮炎居多。该疾病发病迅速，缺乏特效治疗药物，具体发病机制仍不清楚，严重危害广大工人的健康，已成为社会高度关注的职业卫生和公共卫生问题[4]。近年来的研究发现，一类被称为微小RNA(microRNA，miRNA)的非编码小RNA在疾病发生中起着重要的调控作用。miRNA能够与血液中蛋白质形成复合体，稳定的存在于外周血中，疾病状态下miRNA的异常表达，提示miRNA能够作为疾病无创诊断的潜在生物标志物[5]。

本研究运用基因芯片技术，建立OMLDT和三氯乙烯接触者之间血清miRNA差异表达谱，qPCR验证miR-199b在OMLDT中高表达，以往的研究表明，miR-199b与多种疾病的发生和发展有关：miR-199b在宫颈癌组织中高表达[6]，miR-199b通过靶蛋白DDR1抑制乳腺癌淋巴结转移[7]。miR-199b在TCE处理的细胞中差异表达[8]，OMLDT是人群通过接触TCE引起的过敏性反应，miR-199b可能通过细胞凋亡、增殖在OMLDT发生和发展中起作用。对差异倍数2倍以上的miRNA进行靶基因预测，miR-489、miR-409在5个数据库中都预测到了相同的靶基因，miR-489和miR-409 可能通过调控这些靶基因在OMLDT的发生、发展中起作用，为将来进一步研究miRNA在三氯乙烯诱导的药疹样皮炎中的机制指明了方向。其中Spred1是我们预测差异表达miR-409的靶基因，Spred1与Ras结合后，能够抑制胞外信号调节激酶的活化，从而下调 Ras-ERK-MAPK信号通路，MAPK通路在肝脏免疫损伤、肝脏损伤与修复中起着重要作用[9]，miR-409可能靶向调节Spred1的表达，通过下调MAPK信号通路，造成三氯乙烯药疹样皮炎患者的肝损伤。

本研究针对OMLDT，筛选了69个差异表达的miRNAs，预测了其中差异表达miR-409和miR-485的靶基因，尤其是miR-199b经qPCR验证后，可作为OMLDT潜在的分子标志物，为进一步研究OMLDT 患者血清中miRNAs标志物提供了理论基础，具有十分重要的意义。

[1]hong Wenxu，Yang Liang，Liu Jianjun，etal.Proteomic analysis of trichloroethylene-induced alterationsin expression (TAAP)[J].Toxicol Appl Pharmacol，2012，263(2012)：259-272.

[2] Qiang W，Liu Z，Serna VA，etal.Down-regulationofmiR-29b is essential for pathogenesis of uterine leiomyoma[J].Endocrinology，2014；155(3)：663-669.

[3] 中华人民共和国卫生部.GBZ 185-2006 职业性三氯乙烯药疹样皮炎诊断标准[S].北 京：人民卫生出版社，2007.

[4] Wei L，Wenxuh，Yanfang Z，etal.Proteomic profiling of occupationalmedicamentosa-like dermatitisinduced by trichloroethylene in serum based onmalditofms[J].Clin Expmed，2015，15(4)：519-526.

[5] 莫珍珍，高海燕，周瑶，等.淋巴细胞相关miRNAs在肺炎支原体肺炎患儿的表达差异[J].江苏医药，2016，11(2)：142-145.

[6] 李素萍，王兴武，宋宝，等.宫颈癌组织miR-199b表达及其临床意义的初步分析[J].中华肿瘤防治杂志，2012，17(1)：1335-1338.

[7] 李峰.Mir-199b-3p靶蛋白DDR1抑制浸润性乳腺癌腋窝淋巴结转移的临床研究[D].新 乡：新乡医学院，2013.

[8] 张航.TCE致L-02肝细胞毒性中SET相关的表现遗传调控机制的初步研究[D].深 圳：深圳大学，2015.

[9] 曹晨.Spred-2在ConA诱导的小鼠肝炎中的保护作用[D].大连：大连医科大学，2011.

Differentially expressedmiRNA profile in workers with trichloroethylene-inducedmedicamentosa-like dermatitis

ZHENG Jian1，2，LAN Tao2，LIU Wei2，DENG Rongxia2，LI Peimao3，ZHANG Yanfang3，LIU Jianjun1，2，*
(1.Departmentof Preventivemedicine,medicine School ofhunan Normal University, Changsha 410013,hunan; 2.Shenzhen Center for Disease Control & Prevention, Shenzhen 518055, Guangdong; 3.Shenzhen Prevention and Treatment Center foroccupational Disease, Shenzhen 518001, Guangdong, China)

目的： 分析三氯乙烯药疹样皮炎(OMLDT)患者和三氯乙烯接触者血清microRNA(miRNA)表达谱的差异。方法：分别采集5名三氯乙烯药疹样皮炎患者和5名接触者血液，分离血清，抽提总RNA进行Hy3荧光标记，然后浓缩标记的样品，运用miRCURY LNA芯片进行miRNA芯片杂交，杂交后进行图像扫描，所得数据使用GenePix Pro V6.0软件进行miRNA差异表达分析并采用qPCR进行验证。对差异较大的miRNA用miRWalk 2.0进行靶基因预测，并与其他预测软件结果进行比较。结果：OMLDT患者与三氯乙烯接触者比较，共有69个差异表达的miRNAs，其中低表达30个，高表达39个(包含miR-199b)。qPCR验证亦显示miR-199b在OMLDT中高表达。靶基因预测结果显示miR409-3p和miR485-3p在5个预测软件均预测到了共同的靶基因。结论：三氯乙烯药疹样皮炎患者血清miRNAs表达谱发生了显著改变，miR-199b可能是OMLDT潜在的易感生物标志物。

miRNA；三氯乙烯药疹样皮炎；靶基因预测；生物标志物

OBJECTIVE:To profilemicroRNAs expression among workers with trichloroethylene (TCE)-inducedmedicamentosa-like dermatitis (OMLDT).METHODS：Serum samples from 5 patients with OMLDtand with TCE contacts were collected.The total RNA was extracted then labeled withhy3 fluorescent.MicroRNAs werehybridized withmiRCURY LNA chips and images were acquired using the GenePix 4000B scanner，qPCRmethod was used to verify the results ofmiRNAmicroarray.The results were further analyzed by prediction softwares.RESULTS：A total of 69microRNAs were differentially expressed betweenoMLDtand TCE contacts.Among themicroRNAs，39 were upregulated and 30 were down-regulated.Increase ofmiR-199b-5p was verified using qPCR.Target prediction results showed that the same target genes ofmiR-409-3p andmiR-485-3phad been predicted in all forecasting software.CONCLUSION：The study showed that expressionofmicroRNA in serum of workers with OMLDT was significantly altered，andmiR-199bmight serve as a candidate biomarker foroMLDT.

miRNA；occupationalmedicamentosa-like dermatitisinduced by trichloroethylene；target gene prediction；biomarkers

R394.6

A

1004-616X(2016)06-0468-04

1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.06.011

2016-07-12；

2016-11-01

国家自然科学基金(81273126)；深圳市基础研究计划项目(JCYJ 20150402102135497)；深圳市学科布局项目(JCYJ201604281423 16603)

作者信息： 郑 剑，E-mail：653242262@qq.cm。*通讯作者，刘建军，