远志茯神口服液对昆明小鼠的抗应激作用

李得鑫，韩 超，杨金凯，康建南，李 林，包永占*，史万玉*

(1.河北农业大学动物医学院,河北保定 071000;2.湖南圣雅凯生物科技有限公司,湖南湘潭 411228)



远志茯神口服液对昆明小鼠的抗应激作用

李得鑫1，韩 超1，杨金凯1，康建南2，李 林2，包永占1*，史万玉1*

(1.河北农业大学动物医学院,河北保定 071000;2.湖南圣雅凯生物科技有限公司,湖南湘潭 411228)

为探讨远志茯神口服液的抗应激作用，以昆明小鼠为实验动物，研究了不同剂量的远志茯神口服液对慢性应激小鼠生长指标、血清酶活性和免疫球蛋白的影响，以及其对急性应激小鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)的影响。结果显示，一定剂量的远志茯神口服液能显著降低应激小鼠的悬尾不动时间(P<0.05)；显著抑制应激小鼠料重比(P<0.05)和血清酶指标的异常升高(P<0.05)，以及应激小鼠血清免疫球蛋白水平的降低(P<0.05)；还能显著抑制应激小鼠ACTH和COR的释放(P<0.05)。表明远志茯神口服液对悬尾昆明小鼠有显著的抗应激作用。

远志茯神口服液；小鼠；抗应激

在现代规模化的养鸡行业中，接种疫苗和转群时带来的应激影响是不可避免的，在疫苗接种和转群后，机体内发生一系列的不良反应，免疫水平降低，进而病原微生物趁虚而入，对机体造成损伤，对养殖业带来危害和损失。本试验以悬尾刺激造模，以不同剂量的远志茯神口服液给小鼠灌胃。比较分析了各剂量远志茯神口服液对小鼠抗应激作用，为中药抗应激口服液在临床上的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 17 g±2 g和20 g±2 g昆明小鼠各50只，斯贝福(北京)实验科技有限公司提供。

1.1.2 中药口服液 由远志300 g和茯苓200 g组方，按照一定的提取工艺加工而成，每毫升含量相当原生药1 g，湖南圣雅凯生物科技有限公司中试产品。

1.1.3 主要试剂 肌酸激酶(CK)测定试剂盒(批号：150891)、碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒(批号：150891)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒(批号：151201)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒(批号：152381)，均为中生北控生物科技有限公司生产；IgG、IgA、IgM免疫球蛋白检测试剂盒为南京建成生物研究所(批号：20150703)生产；COR ELISA试剂盒、ACTH ELISA试剂盒为莱博泰瑞(北京)科技发展有限公司(生产批号：20150724)生产。

1.1.4 仪器设备 ELx800TM吸收光酶标仪，美国伯腾仪器有限公司产品；UV-2100PC型紫外可见分光光度计，翱艺仪器(上海)有限公司产品；Microlab 300型半自动生化分析仪，荷兰威图科学公司产品。

1.2 方法

1.2.1 远志茯神口服液对慢性应激小鼠的影响 将50只断奶小鼠，雌雄各半，初始体重17 g±2 g，分为5组，每组10只，Ⅰ组～Ⅲ组分别为远志茯神口服液高、中、低剂量组，Ⅳ组为应激阳性对照组，Ⅴ组为空白对照组。Ⅰ组～Ⅲ组小鼠每天分别灌胃0.4 mL中药口服液、0.2 mL中药口服液+0.2mL生理盐水和0.1 mL中药口服液+0.3 mL生理盐水，Ⅳ组和Ⅴ组小鼠每天分别灌服0.4 mL生理盐水。与此同时Ⅰ组～Ⅳ组小鼠每天用双面胶固定倒悬于鼠笼上方的横梁上，悬挂6 min进行应激刺激，再将小鼠放回鼠笼。Ⅴ组小鼠进行正常饲养。各组连续重复灌服并悬尾15 d。每天记录各组小鼠的采食量，称量小鼠体重，计算15 d后日增重、采食量和料重比；另待试验结束后，立即摘眼球取血，分离血清，用于肌酸激酶(CK)、碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的活性测定和血清中IgG、IgA、IgM含量。

1.2.2 远志茯神口服液对急性应激小鼠血清ACTH和COR含量的影响 选取50只昆明小鼠，初始体重20 g±2 g，试验分组和灌胃处理同1.2.1，但不进行每天悬尾处理。10 d后，试验前禁食12 h，最后一次灌胃40 min后开始试验。将小鼠尾部距末端2 cm处用双面胶固定倒悬于鼠笼上方的横梁上，悬挂6 min，记录后4 min累计不动的时间，即悬尾不动时间。立即摘眼球取血，分离血清，用于测定各组小鼠血液中促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质醇(COR)的含量变化。

1.2.3 数据处理 采用SPSS19.0进行数据分析，结果以One-way ANOVA进行差异显著比较，P<0.05有统计学意义，试验数据表示为均值±标准差。

2 结果

2.1 远志茯神口服液对慢性应激小鼠的生长指标的影响

结果见表1。由表1可知，远志茯神口服液3组平均日增重与空白对照组无显著差异(P>0.05)，且各用药组平均日增重均高于阳性对照组，中剂量组与空白对照组无显著差异(P>0.05)；阳性对照组料重比显著高于空白对照组(P<0.05)，远志茯神口服液3组均能降低应激小鼠的料重比，且高剂量组和中剂量组的降低料重比的效果优于低剂量组。

2.2 远志茯神口服液对慢性应激小鼠血清酶活性的影响

结果见表2。由表2可知，从ALT水平来看，远志茯神口服液中剂量组与阳性对照组相比差异显著(P<0.05)；从AST水平来看，远志茯神口服液高剂量组与阳性对照组相比，差异显著(P<0.05)；从CK水平来看，远志茯神口服液中剂量组与阳性对照组相比，差异显著(P<0.05)。从ALP水平来看，远志茯神口服液中剂量组、低剂量组与阳性对照组相比，差异显著(P<0.05)。

表1 远志茯神口服液对慢性应激小鼠生长指标的影响

注：同行数据无肩标或含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，含不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:In the same row,values with no letter or the same letters mean no significant differernce (P>0.05),while with different letters mean significant difference(P<0.05).

表2 远志茯神口服液对慢性应激小鼠血清酶活性的影响

注：同行数据无肩标或含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，含不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:In the same row,values with same letters mean no significant differernce (P>0.05),while with different letters mean significant difference(P<0.05).

2.3 远志茯神口服液对慢性应激小鼠的免疫系统影响

结果见表3。由表3可知，空白对照组3项免疫球蛋白指标均显著高于阳性对照组(P<0.05)。远志茯神口服液高剂量组IgG、IgA、IgM水平与阳性对照组相比，差异显著(P<0.05)，且与空白对照组相比，差异不显著(P>0.05)。

2.4 远志茯神口服液对急性应激小鼠悬尾不动时间的影响

结果见表4。由表4可以看出，远志茯神口服液高、中、低3个组悬尾时间均显著低于应激阳性对照组(P<0.05)。

2.5 远志茯神口服液对急性应激小鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA)的影响

结果见表5。由表5可知，空白对照组ACTH、COR水平均显著低于阳性对照组(P<0.05)。远志茯神口服液低剂量组的ACTH水平与空白对照组相比，无显著差异(P<0.05)；远志茯神口服液

高、低剂量组COR水平与阳性对照组相比差异显著(P<0.05)，且与空白对照组相比无显著差异(P>0.05)。

表3 远志茯神口服液对慢性应激小鼠免疫球蛋白指标的影响

注：同行数据无肩标或含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，含不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:In the same row,values with same letters mean no significant differernce (P>0.05),while with different letters mean significant difference(P<0.05).

表4 远志茯神口服液对急性应激小鼠悬尾不动时间的影响

注：同行数据无肩标或含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，含不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:In the same row,values with same letters mean no significant differernce (P>0.05),while with different letters mean significant difference(P<0.05).

表5 远志茯神口服液对急性应激小鼠促肾上腺激素和皮质醇指标的影响

注：同行数据无肩标或含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，含不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:In the same row,values with same letters mean no significant differernce (P>0.05),while with different letters mean significant difference(P<0.05).

3 讨论

小鼠悬尾试验是用于鉴定和筛选抗抑郁药物的经典动物模型[1]。小鼠在悬尾倒挂这一强烈应激下，最初会强烈挣扎并企图逃离这一环境，挣扎无果后表现绝望出现不动状态，而抗应激药物具有减少不动时间、增强动物抗应激的作用。因此小鼠的悬尾试验也可作为筛选抗应激药物的模型。本试验中，远志茯神口服液高、中、低3个组悬尾时间都显著低于阳性对照组(P<0.05)。这说明远志茯神口服液能显著降低小鼠不动时间，提高抗应激能力。

小鼠受到悬尾刺激后，中枢神经系统识别刺激，随后机体组织发起一系列的生物学反应进行防御，进而影响到动物的采食、消化和吸收。体重下降，机体储备能量耗竭，免疫力遭到破坏，此不仅影响生产性能，也会引起疾病甚至死亡[2]。因此，可以通过测定应激小鼠的增重和饲料转化率来评价抗应激药物的药效。本试验研究发现，小鼠经悬尾应激处理后日增重下降，饲料转化率降低，这与刘晓晖等[3]报道一致。而远志茯神口服液可以缓解这种应激反应，维持正常平均日增重，抑制料重比升高，保证饲料转化率,且中剂量远志茯神口服液效果最好。

AST、ALT主要存在于肝细胞浆内，当肝细胞受损后进入血浆。轻度的肝损伤即可使血清中的ALT显著升高[4]，当重度肝损伤时血清中AST也会快速上升[5]。本试验发现，持续的悬尾应激可以造成小鼠AST、ALT指标的显著升高，表明悬尾刺激对小鼠的肝细胞有一定的损伤。而高、中剂量远志茯神口服液能显著抑制应激小鼠AST、ALT水平的升高，表明其具有较好保护肝细胞的功效；CK主要存在于骨骼肌和心肌的细胞浆和线粒体中，是参与体内的能量代谢的一种酶。一般来说，长时间运动负荷以及一些对机械性影响较大的活动会导致血清肌酸激酶的活性升高[6]。ALP是一种广泛分布于机体肝脏、骨骼等组织的一组同功酶。当肝脏或骨骼系统疾病时会出现ALP偏高。当机体受到应激的刺激时，毛细血管收缩，血管内血流加快，肝脏代谢增强，使ALP释放入血液，血清中ALP水平增高[7]。本试验研究发现，中剂量远志茯神口服液能显著抑制应激小鼠血清中CK和ALP水平的升高，这可能与远志茯神口服液提高机体对应激的耐受性，进而降低应激对机体的刺激，从而使CK和ALP进入血清的量减少有关。

应激会引起交感神经系统和HPA轴(下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴)兴奋，导致儿茶酚胺的快速短期释放。随后，糖皮质激素被释放到循环中[8]，进而抑制抗体的合成，使机体的免疫力降低[9]。IgG、IgA、IgM是体液免疫应答产生的主要抗体[10]，本试验发现，应激状态下小鼠血清IgG、IgA、IgM水平显著较低，而一定剂量的远志茯神口服液能显著抑制应激小鼠血清IgG、IgA、IgM水平的降低。在正常条件下，动物体液内90%以上的皮质酮以高度的亲和力与皮质类固醇结球蛋白结合，但只有血液中游离的皮质醇才能发挥激素的作用[11]。因此，检测血清中促肾上腺皮质激素和皮质醇的含量变化可以反映机体的抗应激情况。本试验表明，在对小鼠短期急性悬尾应激后，小鼠体内ACTH、COR水平会显著增高。一定剂量的远志茯神口服液能显著降低急性悬尾应激小鼠显著升高的ACTH和COR水平。说明远志茯神口服液能抑制应激状态下过分活跃的肾上腺皮质轴，抑制过多的ACTH和COR释放入血，使机体合成IgG、IgA、IgM等抗体的能力得以恢复。远志茯神口服液对悬尾昆明小鼠有显著的抗应激作用。

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[3] 刘晓晖，张 莉，张 岭，等.红景天苷对慢性重复悬尾应激动物的保护作用[J].中国实验方剂学杂志，2011(9)：199-202.

[4] 朱安妮，李 蕊，刘三海，等.四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤模型的建立和优化[J].中国肝脏病杂志:电子版，2014，6(1):27-31.

[5] 傅 颖，王 茵.新生牛肝活性肽对小鼠血清中ALT和AST酶活力的影响[J].中国生物制品学杂志，2007，20(9)：677-679.

[6] 孙桂芳.天鹿胶囊对力竭游泳小鼠CK、BUN、LA的影响[J].山东体育学院学报，2009(11)：43-45.

[7] 胡建斌，卢胜明，车路平，等.10种常见SPF级实验大、小鼠血液学及生化指标正常参考值的探讨[J].实验动物科学，2007，24(2)：5-10.

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Anti-stress Effects ofPolygalaandPoriacocosOral Liquid in Kunming Mice

LI De-xin1,HAN Chao1,YANG Jin-kai1,KANG Jian-nan2,LI Lin2, BAO Yong-zhan1, SHI Wan-yu1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding,Hebei,071000,China; 2.HunanShengyakaiBiologicalTechnicalCo.,Ltd,Xiangtan,Hunan,411228,China)

To investigate the anti-stress effects ofPolygalaandPoriacocosoral liquid,this experiment took Kunming mice as experimental animals,detailedly studied the effects of the different doses ofPolygalaandPoriacocosoral liquid on growth index,serum enzyme activities,the levels of immunoglobulins in mice with chronic stress,and hypothalamus-pituitary-adrenal cortical axis (HPA) in mice with acute stress.The results showed that a certain dose ofPolygalaandPoriacocosoral liquid can significantly reduce the immobility time of suspension tail in mice(P<0.05),inhibit the feed-weight ratio and abnormal elevations of serum enzymes in mice with chronic stress(P<0.05),as well as the decrease of immunoglobulin levels(P<0.05)and the releases of ACTH and COR in mice with acute stress.The result indicated thePolygalaandPoriacocosoral liquid has prominent anti-stress effect in Kunming mice.

PolygalaandPoriacocosoral liquid;mouse;anti-stress

2016-03-18

国家公益性行业(农业)科研专项项目(201403051-08)

李得鑫(1991-)，男，山东潍坊人，硕士研究生，主要从事中药药理学研究。*通讯作者

S852.33

A

1007-5038(2016)11-0070-04