荧光定量PCR测定原发性干燥综合征患者血浆循环DNA及其临床意义

叶俏　严婷婷　史向辉　沈洁　李红胜

荧光定量PCR测定原发性干燥综合征患者血浆循环DNA及其临床意义

叶俏严婷婷史向辉沈洁李红胜

目的 荧光定量PCR测定原发性干燥综合征（pSS）患者血浆循环游离DNA（cfDNA），分析其在疾病中的意义。方法 选用人类基因组管家基因TaqMan® GeneExpression Assays：ABI 4331182，ID：Hs02758991-g1，采用PCR水解探针模式（Taqman探针）测定pSS及正常对照组中血浆cfDNA的值，同时测定pSS患者血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM），并评定pSS的活动指数（SSDAI）和损害指数（SSDDI），分析cfDNA与疾病活动之间的关系。结果 pSS组cf DNA浓度值为（380.64±259.10）μg/L，正常对照组cfDNA浓度值为（32.02±16.39）μg/L，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）；pSS组中：cfDNA浓度与SSDAI呈正相关（r=0.533，P＜0.01），与SSDDI无相关性（r=0.051，P＞0.05），SSDAI与SSDDI呈正相关（r=0.412，P＜0.01），pSS组以SSDAI值中位数4分为2组，31例pSS（SSDAI≥4）的cfDNA浓度值（509.70±215.57）μg/L，35例pSS（SSDAI＜4）的cfDNA浓度值（262.65±186.35）μg/L，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 血浆cfDNA在pSS患者中升高，与干燥综合征疾病活动性相关，血浆cfDNA可作为PSS疾病活动的观察指标。

血浆循环游离DNA 原发性干燥综合征 原发性干燥综合征活动指数 原发性干燥综合征损害指数

原发性干燥综合征（primary Sjögren's syndrome，pSS）是一种以侵犯外分泌腺，尤其是唾液腺及泪腺为主的慢性自身免疫性疾病，以灶性淋巴细胞浸润为病理特点，临床上主要表现为干燥性角结膜炎、口腔干燥症，还可累及其他多个器官及系统。目前诊断pSS应用最广的是2002年修订的国际分类标准［1］。血浆DNA（plasma DNA）存在于循环血液中的细胞外，其能反映机体循环游离DNA（cfDNA）的真实水平。荧光定量RCR因其检测精确且能克服检测中的低敏感度，常用于病毒的测定［3］。本研究通过TAGMAN荧光标记探针定量PCR测定pSS患者血浆cfDNA，分析其与血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白、干燥综合征活动指数（SSDAI）、干燥综合征损害指数（SSDDI）等指标相关性，研究cfDNA在pSS中的应用价值，以期更好地指导临床工作。

1　临床资料

1.1一般资料 2010年8月至2014年8月本院住院与门诊pSS患者66例（观察组）均符合2002年干燥综合征国际分类标准［1］，其中男5例，女61例；年龄23～77岁，平均年龄（52.3±13.1）岁；初发37例，非初发29例，平均病程（57.1±74.5）个月。正常对照组35例，其中男9例，女26例；年龄22～66岁，平均年龄（28.9±6.1）岁。以上入组人员均排除感染、肝炎、结核、创伤、应激、严重的心血管及脑血管疾病急性期等因素。

1.2主要试剂和仪器 DNA提取试剂盒：DNeasy Blood&Tissue Kit（QIAGEN德国），TaqMan® Universal PCR Master Mix：ABI 4304437（美国罗氏），TapMan Control Genomoc DNA（Human）10ng/ul：ABI 4312660（美国），TaqMan® GeneExpression Assays：ABI 4331182，ID：Hs02758991_g1，PCR仪器ABI stepone plus：ABI（美国），日立7060/70C70型生化仪（日本）。

1.3观察指标 ESR、CRP、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM），SSDAI与SSDDI［2］。

2　结果

2.1两组cfDNA值比较 见表1。

表1　两组cfDNA值比较［μg/L，（±s）］

表1　两组cfDNA值比较［μg/L，（±s）］

注：与对照组比较，*P＜0.05

组别浓度值观察组（n=66）380.64±259.10*对照组（n=35）32.02±16.39

2.2观察组cfDNA浓度值与SSDDI、SSDAI、ESR、CRP、免疫球蛋白相关性分析 cfDNA浓度值与SSDAI呈正相关（r=0.533，P＜0.01），cfDNA浓度值与SSDDI无相关性（r=0.051，P＞0.05），SSDAI与IgG呈正相关（r=0.385，P＜0.01），SSDAI与SSDDI呈正相关（r=0.412，P＜0.01），其他指标之间无相关性。

2.3观察组不同cfDNA浓度值患者比较 观察组以SSDAI值=4中位数分为2组，SSDAI≥4共31例cfDNA浓度值（509.70±215.57）μg/L，＜4共35例cfDNA浓度值（262.65±186.35）μg/L，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

3　讨论

本研究所选取样本均排除肿瘤、感染、创伤、心脑血管慢性病等情况。实验结果显示：观察组cfDNA浓度值为（380.64±259.10）μg/L，正常对照组cfDNA浓度值为（32.02±16.39）μg/L，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），与E Bartoloni等［4］相关报道及本课题组在以往相关研究［5］中所得结果一致，再次验证cfDNA在pSS中升高的事实。且研究［4-5］发现cfDNA在pSS患者中升高程度高于SLE，说明cfDNA与pSS患者相关性更具特异性。关于pSS患者cfDNA浓度值升高原因目前尚无明确的研究结论，一些文献报道［6］提出与自身免疫性疾病活动中淋巴细胞产生抗体、炎症因子致病理生理紊乱及活化淋巴细胞分泌核酸及染色体外DNA有关。但是核酸分子的起源仍不清楚，目前认为循环DNA可能是游离的活细胞主动释放的［7］，然而其确切机制有待进一步研究。

同时，本研究观察到cfDNA浓度值与pSS患者的SSDAI呈正相关（r=0.533，P＜0.01），与SSDDI无相关性（r=0.051，P＞0.05），与ESR、CRP、IgG等其他指标无相关性，说明cfDNA浓度值可作为pSS患者疾病活动观察指标。在其他自身免疫性疾病中，如系统性红斑狼疮患者（SLE）［5-6，8］，抗心磷脂抗体综合征患者（APS）［9］相关报道显示相应患者cfDNA浓度值升高，但与疾病活动并无相关性，这也说明cfDNA浓度作为pSS患者疾病活动监测指标的特异性。

此外，本研究不同于其他研究之处在于，将pSS患者组以SSDAI中位数4为界点分为两组，得出结果：SSDAI≥4组共31例cfDNA浓度值（509.70±215.57）μg/L，＜4组共35例cfDNA浓度值（262.65±186.35）μg/L，两者差异有统计学意义（P＜0.01）。此结果更进一步深入说明cfDNA浓度值可反应pSS患者疾病活动，而关于cfDNA浓度值下降能否说明pSS患者疾病活动度降低并将其作为预测指标之一，仍有待于扩大样本量和延长随访时间，而本研究不足之处在于疾病病程选择及分级方面未作详细区分，仍需进一步细化研究。

综上所述，血浆cfDNA浓度值在pSS患者升高，且与SSDAI相关，与SSDDI无关，可能成为PSS疾病活动度判断指标。

［1］Vitali C, Bombardieri S, Jonsson R, et al. For european Study group on classification criteria for SjÖgren's Syndrome. Classification criteria for SjÖgren's syndrome:a revised version of the european criteria proposed by the American-European Consensus Group. Ann Rheum Dis, 2002, 61:554-558.

［2］Vitali C, Palombi G, Baldini C, et al. SjÖgren's Syndrome Disease Damage Index and disease activity index:scoring systems for the assessment of disease damage and disease activity in SjÖgren's syndrome, derived from an analysis of a cohort of Italian patients. Arthritis Rheum, 2007, 56:2223-2231.

［3］Coudray-Meunier C, Fraisse A, Martin-Latil S, et al. A novel high-throughout method for molecular detection of human pathogenic viruses using a nanofluidic real-time PCR system. PLoS One, 2015, 11(1):e0147832.

［4］E Bartoloni, V Ludovini, A Alunno, et al. Increased levels of circulating DNA in patients with systemic autoimmune diseases:A possible marker of disease activity in SjÖgren's syndrome. Lupus, 2011, 20(9):928-935.

［5］叶俏,沈洁,李红胜.血浆循环DNA的浓度在原发性干燥综合征和系统性红斑狼疮中诊治中的意义.浙江医学,2013, 35(18):1637-1639, 1691.

［6］Chen JS, Chen MCt. Possible origin of extra chromosomal DNA from human lymphocytes following in vitro treatment by phytohemagglutinin. Ann NY Acad Sci, 2001, 945(1):289-291.

［7］Van der Vaart M, Pretorius PJ. Circulating DNA:its origin and fluctuation. Ann N Y Acad Sci, 2008, 1137:18-26.

［8］Chen J, Meister S, Urbonaviciute V, et al. Sensitive detection of plasma/serum DNA in patients with systemic lupus erythematosus. Autoimmunity, 2009, 40(4):307-310.

［9］Korabecna M, Ulcova-Gallova Z, Horinek A. Quantification of circulating fetal DNA as a tool for potential monitoring of pregnant patients with antiphospholipid antibodies. Autoimmunity, 2014, 47(7):473-477.

s】 Objective To detect plasma circulating cell-free DNA levels of patients with primary Sjögren's syndrome with real-time fluorescent quantitative PCR，and investigate its clinical significance in groups of primary Sjögren's syndrome（pSS）and disease activity. Methods The primer was designed by human genome housekeeper gene TaqMan® GeneExpression Assays：ABI 4331182，ID：Hs02758991_g1，Levels of cfDNA，erythrocyte sedimentation rate（ESR），C-reaction protein（CRP）and immunoglobulin（IgA，IgG and IgM）in pSS group were detected. Meanwhile，the pSS activity index and damage index of diseases were assessed，and the relations between cfDNA and disease activity were analyzed. Results The levels of plasma cfDNA in pSS group（380.64±259.10）μg/L were apparently higher than those in normal control group（32.02±16.39）μg/L，and the differences were significant statistically（P＜0.05）. In pSS group：cfDNA level was positively correlation with SSDAI（r=0.533，P＜0.01）.But there was no correlation between cfDNA concentration and SSDDI（r=0.051，P＞0.05）；pSS group were divided into 2 groups by SSDAI median value of 4，the cfDNA level of 31 cases of pSS（SSDAI≥4）was（509.70±215.57）μg/L，the cfDNA level of 35 cases of pSS（SSDAI ＜4）was（262.65±186.35）μg/L，and the difference was statistically significant（P＜0.01）. Conclusions The cfDNA is increased in group of pSS，and it is positively correlated with SSDAI；It can be used as one of the disease activity indices of pSS.

Plasma circulating cell-free DNA Primary Sjögren's syndrome Sjögren's syndrome disease activity index Sjögren's syndrome disease damage index

浙江省嘉兴市科技计划项目（2013AY21043-11）

314000 嘉兴学院附属第二医院风湿免疫科

1.4方法 观察组及对照组取静脉血5ml置于EDTA抗凝管中，以800g离心力离心10min后将上清血浆吸置清洁离心管，再离心10min，取上清血浆，继续离心10min，使血浆中的不容物沉淀，完全去除血细胞成分置于干燥洁净冻存管中，-70℃低温冰箱保存备检，统一检测。实时定量PCR扩增定量管家基因，扩增反应采用三步法PCR扩增标准程序。标准曲线由已知浓度的人类基因组DNA（PE Biosystems，CA）倍比稀释后扩增所得。

1.5统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件。计量资料以（±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，相关分析定量资料采用Pearson相关分析；等级资料采用Spearman相关分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。