黑木耳多糖提取工艺优化及其对小鼠巨噬细胞功能的影响

许海林，吴小勇*，聂少平，黄延盛，唐青涛

（1.广东药科大学公共卫生学院，广东 广州 510310；2.广东药科大学食品科学学院，广东 中山 528453；3.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；4.无限极（中国）有限公司，广东 新会 529156）

黑木耳多糖提取工艺优化及其对小鼠巨噬细胞功能的影响

许海林1，吴小勇2,*，聂少平3，黄延盛4，唐青涛4

（1.广东药科大学公共卫生学院，广东 广州 510310；2.广东药科大学食品科学学院，广东 中山 528453；3.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；4.无限极（中国）有限公司，广东 新会 529156）

采用单因素试验及正交试验，考察液料比、搅拌转速、提取时间、提取温度和原料颗粒大小（目数）对黑木耳多糖提取得率的影响，并对黑木耳多糖提取工艺进行优化。通过灌胃法给药，采用小鼠碳廓清实验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光标记微球实验测定黑木耳多糖对小鼠巨噬细胞功能的影响。结果表明：影响黑木耳多糖提取得率的因素排序为，原料颗粒大小＞提取时间＞搅拌转速＞液料比。优化得到的黑木耳多糖提取最佳工艺条件为原料颗粒大小80 目、液料比30∶1（mL/g）、搅拌转速200 r/min、提取时间70 min、提取温度100 ℃（沸水浴加热），此条件下黑木耳多糖提取得率可达8.46%。同时，黑木耳多糖对小鼠体质量、胸腺指数和脾脏指数无显著影响，但能明显提高小鼠单核-巨噬细胞的吞噬能力，说明黑木耳多糖具有提高动物非特异性免疫能力的作用。

黑木耳；多糖；提取工艺；巨噬细胞

多糖具有多种生物活性，如免疫调节功能、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、降血糖、抗凝血、降血脂等，在功能食品和医药领域具有广泛的应用前景[1-5]。黑木耳（Auricularia auricular）隶属于担子菌亚门、层菌纲、木耳目、木耳科和木耳属，是一种药食同源的真菌；多糖是黑木耳的主要生物活性成分[6]。研究[7-11]报道显示，黑木耳多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降胆固醇、降血糖等功能。

近年来，在黑木耳多糖提取方法及工艺优化方面有大量研究[12-17]报道。从文献报道可以看出，目前研究大多集中于液料比、提取温度、提取时间等因素对多糖提取效果的影响；而关于原料颗粒大小（目数）、体系搅拌状况等因素对黑木耳多糖提取得率影响的研究报道不多。本实验考察了液料比、提取温度、提取时间及原料颗粒大小（目数）、搅拌机转速等因素对黑木耳多糖提取得率的影响，对提升黑木耳多糖提取效率具有一定的指导意义。

真菌多糖通过影响免疫细胞如造血干细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、T细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞，产生相应的生物学效应，以增强和激活机体免疫[18-20]。本研究采用小鼠碳廓清实验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光标记微球实验，观察黑木耳多糖对单核-巨噬细胞功能的影响，初步考察黑木耳多糖的免疫调节功能，为黑木耳多糖的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、实验动物与试剂

黑木耳：产自浙江龙泉，由无限极（中国）有限公司提供。

近交系BALB/c小鼠，雌性，18～22 g，合格证号：SCXK（粤）2012-0125，购于广州中医药大学实验动物中心。

Dextran T-40葡聚糖 美国Pharmacia公司；苯酚（分析纯） 上海强顺化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸（分析纯） 广州化学试剂厂；印度墨汁（批号：6003182） 上海亿欣生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

JJ600型精密电子天平 美国双杰兄弟有限公司；AEY-220型电子分析天平 湘仪天平仪器设备有限公司；JB-SH数显恒速强力电动搅拌机 上海标本模型厂；721N型可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；371系列二氧化碳培养箱 美国Thermo公司；Calibur型流式细胞仪 美国BD公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳多糖的提取

准确称取一定量经粉碎、过筛的黑木耳颗粒，置于提取容器中，按照一定的液料比加入相应量的蒸馏水，在一定的温度和搅拌转速条件下加热提取一定的时间（具体提取工艺条件见相应的实验设计），然后用100 目的滤布将提取液过滤出来，加热浓缩（浓缩比为10左右），得黑木耳多糖提取浓缩液，准确称质量，留样待测。

1.3.2 浓缩液多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定浓缩液多糖含量。每次测定时，先制作标准曲线（以葡聚糖为标准），同时采用同样的操作方法测定黑木耳多糖提取浓缩液的多糖含量，需要注意测定前通过醇沉操作将浓缩液中的多糖分离出来，然后再根据测定结果，按下式计算出样品的多糖提取得率：

1.3.3 黑木耳多糖提取单因素试验

选取经粉碎后颗粒大小为40～60 目的黑木耳粉，固定提取液的总体积为600 mL（置于大小为1 L的烧杯中），设定液料比分别为25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1（mL/g），沸水浴加热，搅拌（搅拌机转速均设定为150 r/min）提取50 min，研究液料比对黑木耳多糖得率的影响。随后选择优选出的最佳条件，研究搅拌机转速（100、150、200、250、300 r/min）、提取时间（30、40、50、60、70 min）、水浴加热温度（80、85、90、95、100 ℃）、黑木耳原料颗粒大小（20～40、40～60、60～80、80～100、100 目）对黑木耳多糖得率的影响。

1.3.4 黑木耳多糖提取正交试验

根据单因素试验结果，选取黑木耳原料颗粒大小、液料比、搅拌转速和提取时间这4 个因素为考察因素，每个因素3 个水平，进行L9（34）正交试验，因素与水平见表1。以多糖提取得率为指标，优化出黑木耳多糖提取的最佳工艺条件。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.5 最佳工艺条件验证实验

以正交试验所确定的最佳工艺条件对黑木耳进行多糖提取，验证比较多糖提取得率。

1.3.6 黑木耳多糖的精制

按黎云龙等[21]的方法对黑木耳多糖进行脱色、脱蛋白处理，然后用蒸馏水溶解，再用无水乙醇醇沉，重复3 次，冷冻干燥，得到精制黑木耳多糖，用于动物实验。

1.3.7 动物实验

每天分别灌胃不同剂量（50、100、200 μL）0.5 g/100 mL的黑木耳多糖溶液，连续灌胃30 d，按《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版）的方法进行测定，并计算脏器指数；参照文献[22]的方法进行小鼠碳廓清实验及小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球实验，计算吞噬率及吞噬指数。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 黑木耳多糖提取单因素试验结果

2.1.1 液料比对黑木耳多糖得率的影响

图1 液料比对黑木耳多糖得率的影响Fig. 1 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction yield of crude polysaccharide from A. auricular

图1 显示，随着液料比的升高，黑木耳多糖得率先逐渐升高，在液料比为35∶1（mL/g）时，升至最高，此后，随提取液用量的进一步增加，多糖得率反而有所下降，不同液料比之间的差异有统计学意义（F=72.7，P＜0.05）；说明液料比升高对多糖溶出效果的促进作用有一定的限度，到达极限后再升高液料比，反而会使多糖得率降低。本单因素试验得出的最佳液料比为35∶1（mL /g），低于陈艳秋等[12]的50∶1（mL/g）及魏红等[13]的70∶1（mL/g）；这可能是由于本研究在进行多糖提取时，采用的是搅拌提取，而在上述文献中，多糖的提取采用浸提而导致。

2.1.2 搅拌转速对黑木耳多糖得率的影响

图2 搅拌转速对黑木耳多糖得率的影响Fig. 2 Effect of stirring speed on the extraction yield of crude polysaccharide from A. auricular

选择最佳液料比35∶1（mL/g），改变搅拌机转速，其他提取工艺条件不变，研究搅拌转速对黑木耳多糖得率的影响，结果见图2。结果显示，在搅拌转速为150 r/min时的黑木耳多糖得率明显高于转速为100 r/min（P＜0.05）；但进一步提高搅拌转速，对多糖得率的影响不大，各组多糖得率差异不显著（F=3.14，P=0.046）。加快搅拌转速可以在一定程度上提高体系的传质速率，从而促进黑木耳原料中多糖的溶出；但是，如果搅拌转速太快，原料与提取液（水）之间处于一种相对静止的层状运动状态，将使它们之间的传质效果大大下降，从而导致多糖得率下降；因此搅拌转速并非越快越好。

2.1.3 提取时间对黑木耳多糖得率的影响

图3 提取时间对黑木耳多糖得率的影响Fig. 3 Effect of extraction time on the extraction yield of crude polysaccharide from A. auricular

选择液料比为35∶1（mL /g）、搅拌转速150 r/min，其他提取工艺条件不变，研究提取时间对黑木耳多糖得

率的影响，结果见图3。结果显示，在提取初期，随着提取时间的延长，黑木耳多糖得率逐步提高，方差分析结果表明各组多糖得率有显著差异（F=16，P＜0.05）；当提取时间达到50 min时，多糖得率达到最高；此后，继续延长提取时间，多糖得率差别不大（P＞0.05）；说明进一步延长提取时间，并不能提高多糖得率。本单因素试验得出的最佳提取时间为50 min，大大低于陈艳秋等[12]的3.5 h及魏红等[13]的4 h，与本研究采用了搅拌提取有关；因为搅拌可以提升体系的传质速率，从而缩短提取时间。

2.1.4 提取温度对黑木耳多糖得率的影响

图4 提取温度对黑木耳多糖得率的影响Fig. 4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of crude polysaccharide from A. auricular

选择液料比35∶1（mL /g）、搅拌转速150 r/min、提取时间50 min，其他工艺条件不变，研究提取温度对黑木耳多糖得率的影响，结果见图4。结果显示，随着提取温度上升，黑木耳多糖得率缓慢上升，方差分析结果表明各组多糖得率差异显著（F=23.66，P＜0.05），沸水浴加热（100 ℃）组的多糖得率明显高于其他温度稍低的各组（P＜0.05）；这与魏红等[13]的实验结果一致。

2.1.5 原料颗粒大小对黑木耳多糖得率的影响

图5 原料颗粒大小对黑木耳多糖得率的影响Fig. 5 Effect of raw material particle size on the extraction yield of crude polysaccharide from A. auricular

选择液料比35∶1（mL g）、搅拌转速150 r/min、提取时间50 min、提取温度100 ℃，研究原料颗粒大小对黑木耳多糖得率的影响，结果见图5。结果显示，随着原料颗粒大小的升高，黑木耳多糖得率逐步升高，且各组多糖得率有显著差异（F=44.62，P＜0.05）；说明原料颗粒越细小，其中的多糖越容易提取出来。朱丽云等[23]采用超微粉碎法和普通机械法两种不同工艺获得粗粉、中粉、细粉及极细粉黑木耳，并研究了不同粒径粉末对黑木耳多糖溶出效果的影响，结果发现粉体粒度越小，细胞表面破裂程度越大，黑木耳多糖的溶出量越多。本研究发现颗粒大小为80 目粗多糖得率与100 目差异不大（P＞0.05）；因此选取原料颗粒大小为80 目。

2.2 黑木耳多糖提取工艺正交试验结果

在单因素试验结果的基础上，以黑木耳多糖得率为指标，选取原料颗粒大小、液料比、搅拌转速、提取时间4 个因素为考察因素（提取温度均为沸水浴加热提取），每个设置因素3 个水平，进行L9（34）正交试验设计，结果见表2。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

由表2可知，极差分析结果为RA＞RD＞RC＞RB，说明影响黑木耳多糖得率的因素中，因素A（颗粒大小）的影响最大，其次是提取时间和搅拌转速，液料比的影响最小。优化得到的最佳提取工艺组合是A2B1C2D3，即：原料颗粒大小80 目、液料比30∶1（mL/g）、搅拌转速200 r/min、提取时间70 min。

2.3 最佳工艺条件验证实验结果

按照正交试验优化得到的最佳提取工艺条件，即：液料比30∶1（mL/g）、搅拌转速200 r/min、提取时间70 min、原料颗粒大小80 目，沸水浴加热提取，平行做了5 次实验，多糖得率均在8%以上，平均得率为8.46%，高于正交试验表中各试验的结果；说明按照正交试验优化得到的最佳工艺条件进行提取，确实能够进一步提高黑木耳多糖得率。

2.4 黑木耳多糖对免疫器官脏器指数的影响

表3 黑木耳多糖对小鼠免疫器官指数的影响Table 3 Effect of A. auricular crude polysaccharide on mouse immune organs

从表3可以看出，与正常对照组相比，黑木耳多糖低、中和高剂量组小鼠脾脏指数和胸腺指数都有一定程度升高，但无统计学差异（P＞0.05）。

2.5 黑木耳多糖对巨噬细胞功能的影响

表4 黑木耳多糖对小鼠单核-巨噬细胞和腹腔巨噬细胞功能的影响Table 4 Effect of activity of mouse mononuclear macrophages and peritoneal macrophages

从表4可以看出，与正常对照组相比，除黑木耳多糖高剂量组单核-巨噬细胞的吞噬指数显著升高外（P＜0.05），中剂量、低剂量组小鼠单核-巨噬细胞的吞噬指数均极显著性升高（P＜0.01）；单核-巨噬细胞的吞噬系数结果显示，各剂量组吞噬系数均有升高，但仅中剂量组有显著性升高（P＜0.05）。

表4结果显示，与正常对照组相比，黑木耳多糖各剂量组均显著地增强了小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力（P＜0.05，P＜0.01），且最佳处理为中剂量组。结果说明黑木耳多糖能够活化小鼠腹腔巨噬细胞的功能，增加吞噬能力，发挥其免疫调节作用，这与文献[24]报道一致。

3 结 论

本研究采用水提法进行黑木耳多糖提取，在单因素试验的基础上，通过正交试验，优化得到黑木耳多糖提取的最佳工艺条件为：原料颗粒大小80 目、液料比30∶1（mL/g）、沸水浴加热、搅拌转速200 r/min、提取70 min。在此最佳工艺条件下，黑木耳的粗多糖提取得率均在8%以上，平均得率为8.46%。

动物实验结果表明，每天分别灌胃不同剂量（50、100、200 μL）0.5 g/100 mL的黑木耳多糖溶液，连续灌胃30 d，对小鼠胸腺指数和脾脏指数无显著影响，但可明显提高单核-巨噬细胞的吞噬能力，说明黑木耳多糖具有提高动物非特异性免疫能力的作用。

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Optimization of Extraction Conditions of Crude Polysaccharide from Auricularia auricular and Its Effects on the Functions of Mouse Peritoneal Macrophages

XU Hailin1, WU Xiaoyong2,*, NIE Shaoping3, HUANG Yansheng4, TANG Qingtao4
(1. School of Public Health, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510310, China; 2. School of Food Science, Guangdong Pharmaceutical University, Zhongshan 528453, China; 3. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 4. Infi nitus (China) Co. Ltd., Xinhui 529156, China)

In this study, the extraction conditions of water-soluble polysaccharide from dried fruiting bodies of Auricularia auricular were investigated by single-factor and orthogonal array design methods. The infl uence of liquid-to-solid ratio, stirring speed, extraction time, extraction temperature and the particle size of the dried material on extraction effi ciency was analyzed. The optimal extraction conditions were established based on the extraction yield of polysaccharide. Results showed that the most important factor was the particle size of the dried material, followed by extraction time, stirring speed and liquid-to-solid ratio. The optimal parameters determined in this study were as follows: the particle size, 80 mesh; liquidto-solid ratio, 30:1(mL/g); stirring speed, 200 r/min, extraction temperature, 100 ℃; and extraction time, 70 min. Under these conditions, the polysaccharide yield from A. auricular was 8.46%. The effects of the crude polysaccharide extracted from A. auricular on the immunologic functions of mouse macrophages were also investigated through carbon clearance test and peritoneal macrophage phagocytosis function test using fl uorescence labeled microspheres. Additionally, the effects of the crude polysaccharide on immune organs were also examined. Results indicated that while the crude polysaccharide had no signifi cant infl uences on the body weight, thymus index or spleen index of the animals, it signifi cantly improved the phagocytosis of mononuclear macrophage. In conclusion, the crude polysaccharide extracted from A. auricular can enhance animal nonspecifi c immunity.

Auricularia auricular; polysaccharide; extraction process; macrophage

10.7506/spkx1002-6630-201610017

TS201.2

A

1002-6630（2016）10-0100-05

许海林, 吴小勇, 聂少平, 等. 黑木耳多糖提取工艺优化及其对小鼠巨噬细胞功能的影响[J]. 食品科学, 2016, 37(10): 100-104. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610017. http://www.spkx.net.cn

XU Hailin, WU Xiaoyong, NIE Shaoping, et al. Optimization of extraction conditions of crude polysaccharide from Auricularia auricular and its effects on the functions of mouse peritoneal macrophages[J]. Food Science, 2016, 37(10): 100-104. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610017. http://www.spkx.net.cn

2015-08-10

南昌大学食品科学与技术国家重点实验室开放基金项目（SKLF-KF-201408）

许海林（1984—），女，硕士研究生，主要从事多糖结构与功能研究。E-mail：xuhailin505@163.com

*通信作者：吴小勇（1972—），男，副教授，博士，主要从事功能性食品的研究与开发。E-mail：perryfe@163.com