铁皮石斛γ射线诱变及后代变异研究

谢小波，孙崇波，宋仙水

（1.浙江省农业科学院 园艺研究所，浙江 杭州 310021；2.浙江铁枫堂科技股份有限公司，浙江 乐清 325616）

铁皮石斛γ射线诱变及后代变异研究

谢小波1，孙崇波1，宋仙水2

（1.浙江省农业科学院 园艺研究所，浙江 杭州 310021；2.浙江铁枫堂科技股份有限公司，浙江 乐清 325616）

为获得铁皮石斛原球茎γ射线辐照的合适剂量，以铁皮石斛品种仙斛1号为材料，对它的原球茎进行了137Cs-γ射线的辐照研究，并对其后代变异作了分析。结果表明：在1.0Gy·min-1辐照剂量率下，3个月后，50，70，90，110和120Gy辐照剂量的原球茎存活率分别为100%，89.6%，35.2%，13.1%和0，曲线拟合半致死剂量为86.4Gy；经6个多月的培养后，以没有辐照的材料作为对照，分子标记SSR和ISSR分析表明，70，90和110Gy辐照后差异条带比率分别为1.01%，1.52%和2.53%；组培10个月后测定幼苗茎中的石斛多糖含量，辐照前后比较差异均不显著。研究认为，1.0Gy·min-1的剂量率下，半致死剂量86.4Gy附近的剂量可用于铁皮石斛原球茎的辐照诱变处理。

铁皮石斛；原球茎；137Cs-γ射线辐照；分子标记；遗传变异；石斛多糖

铁皮石斛（DendrobiumofficinaleKimuraet Migo）为兰科石斛属植物，性味甘、微寒，具有益胃生津、滋阴清热功效，是名贵中药材之一，在中医养生、保健方面有显著作用，并作为单味中药饮片被收录于 《中国药典》 （2010版）［1］。铁皮石斛良好的功效也曾引发了人们对其野生资源的过度采集，造成了自然铁皮石斛种质资源的濒临灭绝，引发了人们对铁皮石斛野生资源保护的思考和研究［2］。同时在旺盛的市场需求促动下，铁皮石斛人工栽培及其加工产业获得了快速发展［3-4］，成就了今天年产值超几十亿的单味药材市场规模［5］。近几年来随着产业规模的扩展，铁皮石斛的育种、遗传等研究也取得了进步，新品种在不断推出，如天斛1号、仙斛1号、仙斛2号、森山1号等［6-8］。在铁皮石斛育种研究中，野生资源驯化筛选、组培等手段在前期得到了大力应用，在积累了一定育种材料之后，目前杂交、辐照等育种技术也开始应用［9-10］。γ射线辐照可以创造突变体，如水稻、玉米、中药材等［11-13］，但在铁皮石斛上应用尚缺少经验。本研究开展了不同辐照剂量的比较试验，以期获得以铁皮石斛原球茎为对象的适合的γ射线辐照剂量，并分析后代辐照群体的变异情况，以便从中筛选理想的遗传和育种研究材料。

1 材料与方法

1.1 材料

以铁皮石斛品种仙斛1号的原球茎为材料，该品种具有铁皮石斛典型的黑节、铁锈色等特征，综合性状优良［11］。原球茎增殖培养基为：MS+ 0.5mg·L-16-BA+0.8mg·L-12，4-D+2.0g· L-1活性炭 （AC）。原球茎通过增殖培养铺满培养基表面，然后进行137Cs-γ射线的辐照处理。辐照后的原球茎立即转接到新的增殖培养基，并在培养2个月和3个月时分别统计原球茎死亡率，3个月后原球茎的死亡情况已基本稳定。未死亡原球茎转接到幼苗分化生长培养基：MS+1.2mg·L-16-BA+0.2mg·L-1IBA+2.0g·L-1AC，促使幼苗分化和伸长生长。再经6个月采叶片进行分子标记检测，10个月后取瓶内小苗的茎进行粗多糖含量测定。以未经辐照处理的仙斛1号原球茎为对照，培养条件与辐照材料相同。

1.2 辐照方法

辐照材料采用45d培养并生长旺盛的原球茎，连同培养瓶一起送到辐射源室内进行137Cs-γ射线辐照 （在浙江省农业科学院辐照中心进行），辐射剂量率为1.0Gy·min-1，辐射剂量分别设为50，70，90，110，120和 140Gy，每个剂量辐照原球茎1瓶，每瓶均有大量原球茎，但没有统计确切数量。辐照以后，每个剂量处理的原球茎立即转接到4～8瓶新的增殖培养基进行继代培养。

注：本研究得到浙江铁枫堂科技股份有限公司、温州市政府和乐清市政府的资助，是陈剑平院士乐清铁皮石斛工作站研究内容之一，整个过程得到陈剑平院士的指导。在此一并表示衷心的感谢！

1.3 DNA提取和分子标记分析

DNA提取采用Qiagen试剂盒，并按照试剂盒的说明进行提取。DNA提取所用样品均为混合采样，一个群体采集30株小苗的叶片进行混合提取。

分子标记分析采用SSR和ISSR2种标记类型，SSR分子标记采用已发表的标记［14-17］，ISSR主要为UBC系列 （哥伦比亚大学开发）。SSR和ISSR的反应体系相同，均为：反应总体积25μL，其中模板 DNA1.0μL（25ng），随机引物 （浓度10μmol·L-1）1.0μL，10×PCRBuffer2.5μL，MgCl22.0μL，dNTPs2.0μL，Taq酶1U，加ddH2O至25μL。反应所用试剂均购自上海生物工程有限公司。

SSR的PCR反应程序为：94℃预变性4.0min，然后94℃40s，50～60℃45s，72℃1.5min，共35个循环，最后72℃延伸5.0min。ISSR的反应程序为：94℃预变性5.0min，然后94℃1.0min，50～60℃1.0min，72℃2.0min，共35个循环，最后72℃延伸7.0min。SSR的PCR产物用聚丙烯酰胺非变性凝胶或高分辨率琼脂糖凝胶电泳，ISSR的PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳。

1.4 石斛多糖测定

石斛多糖测定也采用混合采样的方法，即在同一个群体中采集30株小苗的茎段混合后进行测定。石斛多糖提取按照 《中国药典》 （2010年版）中描述的方法进行［1］，并略有修改。标准曲线制作方法：配制无水葡萄糖溶液，每 1mL含90μg，取溶液 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，分别置10mL具塞试管中，各加水补至1.0mL，精密加入5%苯酚溶液1mL（临用配制），摇匀，再加硫酸5mL，摇匀，置沸水浴中加热20min，取出，置冰浴中冷却5min，以相应试剂为空白，照紫外—可见分光光度计488nm的波长处测定吸光度，制作标准曲线。样品制备方法：称取新鲜样品1.0g，加水200mL，加热回流2h，放冷，转移至250mL量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，过滤，精密量取滤液2 mL，置15mL离心管中，精密加入无水乙醇10mL，摇匀，冷藏1h，取出，4000r·min-1离心20min，弃去上清液，沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀备用。量取供试品溶液1mL，同标准样品制备方法，488nm测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 不同辐照剂量对铁皮石斛原球茎生长的影响

采用 7种137Cs-γ射线辐照剂量：0，50，70，90，110，120和140Gy对仙斛1号的原球茎进行辐照，然后进行继代培养。在开始培养的3个月中，除去少量污染的以外，每种处理剂量最后均保存了3瓶以上原球茎，从中各取3瓶统计并比较存活率差异。结果表明：辐照后的原球茎经转接培养，原球茎逐渐死亡，且辐照剂量越大死亡越快。3个月后，不再有新的原球茎死亡发生。统计存活率表明，50Gy辐照的原球茎几乎没有死亡，70，90和110 Gy辐照的原球茎存活率分别为89.6%，35.2%和13.1%，而大于120Gy的原球茎则完全死亡，除0和50Gy没有原球茎死亡发生外，其余各处理间经t检验均为极显著差异；原球茎增殖倍数比较表明，各剂量处理之间均存在极显著差异 （表1）。在1.0Gy·min-1的辐照剂量率下，对辐照剂量和原球茎存活率进行了曲线拟合，得到原球茎存活率与辐照剂量的关系方程为：y=-1.5409x+183.18（y为存活率，%；x为辐照剂量，Gy），其中R2=0.959 2，计算获得半致死剂量LD50值为86.4Gy。

表1 不同137Cs-γ射线辐照剂量对铁皮石斛原球茎的存活和生长影响

2.2 辐照对铁皮石斛遗传变异的影响

对未辐照和辐照后的原球茎进行了继代繁殖和伸长、生根培养，在0，50，70，90和110Gy等5份材料中，在形成小苗后，分别剪取30株苗的少许叶片并混合提取DNA，用于分子标记分析。从公开发表的 SSR文库中筛选了扩增良好的标记，主要包括Gu等［14］的DO系列11个，Yue等［15］OA系列 10个，谢明璐等［16］XML系列 13个和 Lu等［17］DOeSSR系列96个，合计130个位点。另外采用ISSR标记17个，其中UBC系列10个，ISSR系列7个，共扩增获得68个位点。2种分子标记一共获得198个位点的扩增条带。测定结果表明，2种分子标记中，少数标记在样品间表现出差异条带，如SSR标记XML6、ISSR标记UBC825（图1）。最终，与未辐照的亲本比较，50Gy辐照的群体没有检测到差异条带，70，90和110Gy测得差异条带比率分别为1.01%，1.52%和2.53%，表明原球茎部分发生了DNA水平变异，且变异发生程度与辐射剂量存在一定正相关。

图1 分子标记在铁皮石斛辐照群体中的差异扩增

2.3 辐照对石斛多糖含量的影响

石斛多糖含量常被用来衡量铁皮石斛品质优劣的一个重要指标，因此，我们也对辐照前后的铁皮石斛进行了石斛多糖的测定。辐照前后的原球茎同时经过3次继代培养，10个月以后形成了约10cm高的小苗，分别在每个群体中取30个小苗的茎段进行石斛多糖含量测定。结果表明，辐照前后的铁皮石斛多糖含量没有检测到显著差异 （表2）。

表2 辐照对铁皮石斛多糖含量的影响

3 讨论

在1.0Gy·min-1的辐照剂量率下，通过曲线拟合获得铁皮石斛原球茎γ射线辐照半致死剂量为86.4Gy，这对我们开展铁皮石斛原球茎辐照诱变研究有较好参考意义，但在不同的材料中是否有类似效果仍需要实验验证。这一结果与詹忠根等［10］67.23Gy半致死剂量有差异，可能原因是2项研究采用的剂量率不同，詹忠根等使用的剂量率为5.0Gy·min-1。辐射剂量率与半致死剂量在动物和医学上有研究，通常两者有反比关系［18］，但在植物上少有报道。从本实验结果看，我们认为在1.0Gy·min-1的剂量率下，采用80～100Gy诱变铁皮石斛原球茎是比较适合的辐射剂量。

分子标记可以用于突变性状的连锁检测和基因的定位分析，从而为育种辅助选择提供帮助，分子标记技术已成熟应用于各类物种的育种、遗传等方面研究［18-19］。本项目采用SSR和ISSR分子标记检测后代遗传变异情况，从一个侧面真实反映了辐照后的材料在DNA水平发生了某些序列变化。但此类分子标记在扩增的片段中对某些情况的碱基替换、倒位等情况不能做出确切判断。因此，所检测的结果可以作为参考，部分反映辐照材料后代发生变异的情况。在后续的研究中，需要进行单株测定，包括在农艺性状、生理指标等方面进行多角度比较分析。像石斛多糖含量指标的分析，只有在较大的群体中进行单株筛选才有可能获得石斛多糖积累发生了突变的植株。

石斛多糖是铁皮石斛中含量最多的生理活性物质，并常被用来衡量铁皮石斛的品质［20-22］。因此，我们也着重对辐照前后石斛多糖含量进行了比较。分析结果表明，该多糖含量在辐照前后并没有达到显著差异，这说明在混合采收的样品中，产生的变异可能并不足以影响辐照群体石斛多糖含量的水平，也表示突变的概率可能比较低，这与其他作物获得的结果具有相似之处。因此，在实践应用中，我们要在保证部分材料存活的前提下尽可能提高突变发生的概率，同时还要增加群体量和采用单株选择的方法，提高筛选效率。

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（责任编辑：张 韵）

S567

A

0528-9017（2016）05-0687-04

2015-12-31

院士工作站项目；浙江创意农业工程技术研究中心 （2013E10037）；院地科技合作项目 （WZ20130006）

谢小波（1968—），男，副研究员，博士，研究方向为中药材遗传育种研究工作，E-mail：xiaoboxie@yahoo.com。

文献著录格式：谢小波，孙崇波，宋仙水.铁皮石斛γ射线诱变及后代变异研究 ［J］.浙江农业科学，2016，57（5）：687-690.

10.16178/j.issn.0528-9017.20160523