Fingolimod对小鼠慢性胰腺纤维化的抑制作用

崔立华，张淑坤，卓玉珍，李彩霞，张　一，刘洪斌，崔乃强

实验研究

Fingolimod对小鼠慢性胰腺纤维化的抑制作用

崔立华1，张淑坤1，卓玉珍1，李彩霞1，张一1，刘洪斌2，崔乃强3

目的：观察新型免疫抑制剂Fingolimod(FTY720)对雨蛙素致小鼠慢性胰腺纤维化的治疗作用。方法：健康雄性C57BL/6小鼠30只，随机分为对照组、模型组和FTY720治疗组。模型组和治疗组腹腔注射雨蛙素，50 μg·kg-1·次-1，1周3次，连续6周；治疗组于第5周开始注射FTY720，1 mg·kg-1·d-1，持续2周；对照组腹腔注射等量的生理盐水。于第7周第1天留取胰腺组织，行HE染色和苦味酸-天狼星红染色，分别于光镜和偏振光显微镜下观察病理改变和评分，并用免疫组织化学染色法观察α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、CD3、FOXP3表达情况。结果：模型组病理评分中，腺泡萎缩为2.52±0.36，炎细胞浸润为3.42±0.31，纤维化程度为3.25±0.42，显著高于对照组的病理评分。模型组α-SMA表达为25.33±5.64，CD3表达为68.83±8.38，FOXP3表达为34.83±6.85，均显著高于对照组（分别为0.33±0.52，1.83±0.75，1.33±0.82）。治疗组病理评分中，腺泡萎缩为1.69± 0.27，炎细胞浸润为2.34±0.33，纤维化程度为2.19±0.35，均较模型组明显减少。治疗组胰腺组织中α-SMA表达为12.33±2.58，CD3为25.00±4.93，FOXP3为17.33±4.41，也明显低于模型组。结论：FTY720能明显减少雨蛙素所致的T淋巴细胞浸润和调节性T细胞数量，在一定程度上减轻胰腺间质胶原的表达，从而抑制胰腺纤维化程度。

FTY720；胰腺纤维化；雨蛙素；调节性T细胞

Treg）是T淋巴细胞中的CD4+细胞群，有研究证实心梗后Treg能减轻心脏重塑[7]，此外Treg还与肝、肺纤维化密切相关[8-9]。本研究通过雨蛙素反复刺激制备胰腺纤维化模型，同时FTY720进行干预，探讨FTY720对于胰腺纤维化的作用及机制。

1　材料与方法

1.1动物健康雄性C57BL/6小鼠，体质量19～22 g，购自中国食品药品检定研究院。

1.2主要试剂与仪器FTY720购自MCE公司，雨蛙素为Sigma产品。小鼠I型胶原试剂盒购自CUSABIO公司。天狼星红购自Fluka公司。兔抗小鼠CD3,FOXP3抗体购自abcam公司，兔抗小鼠α平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）抗体购自Santa Cruz公司。DM4000B型研究级显微镜为德国Leica公司产品，BX53型偏振光显微镜为日本OLYMPUS公司产品。

1.3分组及模型制作健康雄性C57BL/6小鼠30只，随机分为3组。模型组和治疗组每周1、3、5腹腔注射雨蛙素，每天6次，注射间隔为1 h，剂量每次50 μg/kg，连续6周[10]。治疗组注射雨蛙素4周后,每天注射雨蛙素前30 min给予FTY720 1 mg·kg-1·d-1，持续到第6周。对照组仅注射生理盐水。实验结束后麻醉、开腹，留取胰腺组织，福尔马林固定。

1.4HE普通病理组织学观察及评分福尔马林固定的组织常规脱水，石蜡包埋，5 μm切片，行HE染色，光镜下观察，并进行胰腺腺泡细胞萎缩、炎性细胞浸润及纤维化程度评分[11]。

1.5苦味酸-天狼星红染色切片脱蜡水化，蒸馏水洗3次，入饱和苦味酸-天狼星红液染15 min，流水冲洗浮色，无水乙醇分化，镜下控制染色，苏木素复染细胞核。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下和偏振光显微镜观察胰腺纤维化及胶原分型。

1.6免疫组织化学染色观察α-SMA、CD3、FOXP3表达情况胰腺组织切片常规脱蜡至水，加入1∶100稀释的α-SMA、CD3、FOXP3一抗，4℃过夜（PBS代替一抗作阴性对照），然后加入羊抗兔/羊抗鼠IgG-HRP作用30 min。DAB显色,苏木精复染。以细胞内出现黄、棕色颗粒为阳性细胞。用Leica Image Analysis软件，对各组切片单位面积阳性细胞数进行定量分析，每张切片任取10个视野取其平均值。

1.7统计学方法采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间差异采用方差分析，P＜0.05被认为有统计学意义。

2　结果

2.1病理组织学观察及评分对照组胰腺组织小叶结构基本正常。模型组胰腺组织中小叶腺泡萎缩、消失，小叶间质明显纤维组织增生，大量炎性细胞浸润（图1）。治疗组腺泡仍有部分腺泡萎缩，纤维增生不明显，有炎细胞浸润，与模型组相比，腺泡萎缩、炎细胞浸润及纤维化程度评分有明显的下降（表1）。

图1　胰腺组织HE染色（100×）

2.2苦味酸天狼星红胶原染色观察胰腺间质胶原增生情况模型组小鼠胰腺组织中胶原纤维含量较对照组明显增多，且以黄、橙、红色的粗纤维状Ⅰ型胶原纤维为主。治疗组胰腺组织中的胶原纤维比模型组明显减少，胶原主要分布在胰腺小叶间，腺泡之间较少（图2）。

表1　3组小鼠胰腺病理组织学评分比较(±s)

表1　3组小鼠胰腺病理组织学评分比较(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05;与模型组比较，bP＜0.05

组别对照组模型组治疗组n 10 10 10腺泡萎缩0 2.52±0.36a1.69±0.27b炎细胞浸润0 3.42±0.31a2.34±0.33b纤维化程度0 3.25±0.42a2.19±0.35b

图2　胰腺组织饱和苦味酸-天狼星红染色(100×)

2.3胰腺组织α-SMA表达情况对照组基本未见α-SMA表达，与对照组相比，模型组胰腺组织α-SMA阳性染色细胞显著增多，广泛分布于腺泡周围及小叶间质。治疗组胰腺组织α-SMA阳性细胞比模型组明显减少，只可见少量表达(图3,表2)。

图3 胰腺组织α-SMA表达情况

2.4胰腺组织CD3，FOXP3表达情况与对照组相比，模型组胰腺组织CD3，FOXP3阳性染色细胞显著增多，主要分布于损伤腺泡周围；治疗组胰腺组织CD3，FOXP3阳性细胞比模型组明显减少（图4，表2）。

表2 胰腺组织α-SMA，CD3，FOXP3阳性表达数量

图4　CD3，FOXP3表达情况

3　讨论

胰腺星状细胞（pancreatic stellate cell，PSC）活化，胶原大量生成，细胞外基质增多是胰腺纤维化的重要病理过程[1]。雨蛙素是一种胆囊收缩素类似物,可刺激胰腺外分泌部，使胰蛋白水解酶分泌大量增加，从而引起胰腺腺泡的自溶，雨蛙素反复刺激可以产生明显的胰腺纤维化。本研究显示，雨蛙素反复腹腔注射6周，模型组小鼠产生了明显的胰腺慢性炎症及纤维化病变。腺泡明显萎缩，大量炎细胞浸润，胶原纤维增生明显，主要分布于胰导管及萎缩变性的腺泡细胞旁和小叶间。PSC是胰腺纤维化的主要效应细胞，模型组中PSC活化标志物α-SMA大量表达。

FTY720是传统中药冬虫夏草中提取的有效成分多球壳菌素，通过结构改造而合成的一种新型的免疫抑制剂，在体内被鞘氨醇激酶2磷酸化为FTY720-P,作用于淋巴细胞表面的鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine 1 phosphate，S1P）受体,其中 S1P1受体是淋巴细胞再循环的必需成分[12-13]。FTY720-P通过Akt和Erk的信号传导通路,调节淋巴细胞向次级淋巴组织内聚,从而减少淋巴细胞数量[14]。也有研究发现，FTY720可以通过影响 Bcl2/Bax比值,降低线粒体跨膜电势,释放细胞色素C,最终启动Caspase酶系,从而导致淋巴细胞凋亡[15]。本研究发现,FTY720可明显减少胰腺腺泡损伤，减少胰腺间质淋巴细胞浸润，T淋巴细胞（表面分子标志CD3）显著减少,下调α-SMA和胶原表达,胰腺纤维化程度明显减轻。

淋巴细胞通过分泌多种淋巴因子参与纤维化过程，来源于病人的T淋巴细胞培养上清液能够促进成纤细胞胶原合成[16]。调节性T淋巴细胞（regulatory T lymphocyte，Treg）是CD4+T淋巴细胞亚群，具有免疫调节功能，对机体维持免疫耐受和细胞内稳态发挥重要作用，转录因子FOXP3（Fork head/winged helix transcriptionfactor）是 Treg的特征性标志之一[17-18]。Treg有低反应性和免疫抑制性两大特性，其作用机制可能是通过细胞间直接接触和（或）分泌抑制性细胞因子，在维持机体免疫内环境稳定、防止自身免疫性疾病发生、抑制肿瘤免疫等方面都起着重要作用。已有研究表明，Treg与心脏纤维化密切相关[7]。Treg能够直接促进上皮细胞分泌TGF-β，并与成纤维细胞接触，增强自身增殖、分化以及分泌TGF-β 的能力。Treg还可以通过促进趋化因子CCL2，CCL3的表达,作用于成纤维细胞表面受体，促进纤维化发生[19-20]。

在本研究中，雨蛙素所致的模型组中，CD3+增多，FOXP3+增多，α-SMA、胶原表达增多。在FTY720治疗组中，CD3+、FOXP3+、α-SMA以及胶原表达都比模型组中减少。在两组中，在T淋巴细胞、Treg细胞以及胶原表达上都有明显的一致性，可见T淋巴细胞/Treg与纤维化有明显的相关性。但关于T淋巴细胞/Treg如何影响PSC增殖及活化，FTY720如何影响PSC，还需要进一步的研究。

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（收稿：2016-02-26修回：2016-05-16）

（责任编辑刘洪斌屈振亮）

Inhibitory Effect of Fingolimod in Pancreatic Fibrosis

CUI Li-hua,ZHANG Shu-kun,ZHUO Yu-zhen,et al.Institute of Chinese and Western Medicines for Acute Abdominal Diseases,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin (300100),China

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of Fingolimod(FTY720)in cerulein induced pancre⁃atic fibrosis.MethodsThirty male C57BL/6 mice were divided into control group,model group and FTY720 treated group（10 animals per group).The model mice and FTY720 treated mice were creased markedly in FTY720 group mice.ConclusionFTY720 could reduce the T lymphocytes infiltration and regulatory T cell quantity,thus alleviate the accumulation of collagen in pancrease.FTY720 inhibit pancre⁃atic fibrosis may be related to these.

repeated intraperi⁃toneal injection of cerulein for six weeks.The FTY720 group mice

intraperitoneal injection of FTY720 (1 mg/kg/d)after the fourth week.The control group mice

saline injections.Seven weeks after the first intraperitoneal injection of cerulein the pancreas was removed for pathological assessment of acinar atrophy,in⁃flammatory infiltration and fibrosis.The second part was stained with picric-sirius red and observed by polarized light microscopy.The third part of pancreatic specimen was used to examine α-smooth muscle actin(α-SMA), CD3 and FOXP3 expressionby immunohistochemical method.ResultsCompared with control group,the pathological score in model group mice(acinar atrophy 2.52±0.36 vs 0，inflammatory infiltration 3.42±0.31 vs 0，fibrosis 3.25±0.42 vs 0)was higher and much more expression of collagen in model mice.The expression of α-SMA（25.33±5.64 vs 0.33±0.52）、CD3（68.83±8.38 vs 1.83±0.75）and FOXP3（34.83±6.85 vs 1.33±0.82）were all increased in model mice.Compared with model group,the pathological score in FTY720 group(acinar atrophy 1.69±0.27 vs 2.52±0.36，inflammatory infil⁃tration 2.34±0.33 vs 3.42±0.31，fibrosis 2.19±0.35 vs 3.25±0.42)was lower and the expression of collagen was decreased.The expression ofα-SMA（12.33± 2.58 vs 25.33±5.64）、CD3（25±4.93 vs 68.83±8.38）and FOXP3（17.33±4.41 vs 34.83±6.85）were all de⁃

FTY720;pancreatitis fibrosis;cerulein;regulatory T lymphocyte胰腺纤维化是慢性胰腺炎的典型病理表现，在慢性胰腺炎和胰腺癌中发挥着重要作用[1]。Fingolimod(FTY720)是一种新型的免疫抑制剂,是由冬虫夏草提取物中具有免疫抑制作用的成分多球壳菌素（myriocin，ISP-1）进行化学修饰而成[2]，具有显著的免疫抑制效果,可显著减少外周血中活化T和B淋巴细胞，减少淋巴细胞向移植器官内浸润，且不良反应较少，在器官移植、自身免疫性疾病中显示出很好的治疗效果[3-4]。淋巴细胞反应与纤维化密切相关，已有研究表明，活化的淋巴细胞能够增强慢性肝炎的肝纤维化[5]，T淋巴细胞在纤维化过程中发挥重要作用[6]。调节性T淋巴细胞（regulatory T lymphocyte，

Q95-33;R657.5

A

1007-6948(2016)03-0261-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2016.03.015

天津市卫生局基金（2013KY27）

1.天津市中西医结合急腹症研究所细胞及分子生物学实验室（天津 300100）

2.天津市医药科学研究所（天津 300700）

3.天津市南开医院肝胆胰外科（天津 300100）

崔乃强，E-mail:nctsui@126.com