外周血吲哚胺2,3-双加氧酶和梅毒血清固定关系的研究

韩 莉，谢 震，王有为，刘杨英，万慧颖，周 敏

外周血吲哚胺2,3-双加氧酶和梅毒血清固定关系的研究

韩 莉，谢 震，王有为，刘杨英，万慧颖，周 敏

韩　莉

目的研究外周血吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)和梅毒血清固定的关系。方法采用前瞻性病例对照研究的方法，用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离血清固定患者与无血清固定患者和健康对照组的外周血单个核细胞(PBMC)，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测PBMC中的IDO。结果梅毒患者的IDO蛋白要显著高于健康对照，血清固定患者的IDO蛋白要显著高于无血清固定的患者，多变量Logistic回归分析模型显示梅毒患者外周血IDO水平升高与血清固定密切相关。结论IDO可能参与了梅毒血清固定和免疫耐受。

梅毒；血清固定；外周血；吲哚胺2,3-双加氧酶

梅毒是由苍白螺旋体所引起的性传播疾病，几乎可以侵犯全身各器官和系统，造成多器官损害。近年来梅毒出现了重新流行的迹象[1]。中国梅毒的发病率由2000年的6.43/10万增长到2013年32.86/10万，年均增长13.37%[2]。青霉素是治疗梅毒的一线药物，但是疗效不尽人意。血清学指标可以反映驱梅疗效，部分患者在正规驱梅治疗后，非梅毒螺旋体抗体滴度下降到一定程度后就不再下降，而长期维持在低滴度水平，这一现象被称为血清固定。血清固定没有有效的处理方法，只有27%对治疗有反应[3]，成为治疗上的一个难题。其具体机制目前尚不完全清楚[4]，可能与免疫耐受以及宿主细胞免疫功能受损有关[5]。

吲哚胺2,3-双加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO）是细胞质内将色氨酸沿犬尿氨酸途径代谢的限速酶，该酶通过多种途径介导免疫耐受[6]，近年受到广泛关注。为探索IDO在梅毒发病中的作用和意义，本文研究了该酶和未来血清固定之间的相关性。

1　对象和方法

1.1研究对象

设计为前瞻性病例-对照研究。血清固定者设为病例，无血清固定者为对照。将四川省医学科学院四川省人民医院皮肤病性病研究所首次诊断的218例梅毒患者作为候选的研究对象。病例排除标准：①人免疫缺陷病毒（HIV）或肝炎标志物检测阳性以及并发其他性传播疾病者；②并发可能影响免疫功能的疾病，包括肿瘤、自身免疫性疾病、营养不良、肾功能衰竭或其他可能的感染；③脑脊液检查阳性，其他神经、眼、血管或其他三期内脏梅毒受累者；④孕妇、随访期间有非婚性生活史者；⑤未采用青霉素治疗；⑥近1个月使用过可能影响免疫功能的药物，包括免疫抑制剂或免疫调节剂；⑦患者不同意参加研究；⑧未完成24个月的随访。共有178例梅毒患者符合条件（图1）。

图1　纳入研究的梅毒患者流程

首次诊断时的资料为基线值。218例患者在基线时检测了外周血IDO水平。研究同期的10例健康志愿者作为研究IDO水平的对照。患者均采用苄星青霉素240万 U双臀肌内注射，每周1次，连续3周。治疗后第1年每3个月复诊1次，第2年每半年复诊1次。随诊期间检查快速血浆反应素试验（RPR）。血清固定的定义依照中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会性病学组制定的《梅毒血清固定临床处理专家共识》的标准[7]。标本使用符合赫尔辛基宣言和医学伦理，并征得研究对象的知情同意。

1.2检测方法

在基线时收集所有研究对象的全血，用Ficoll-Paque密度梯度离心法（GE Healthcare，Uppsala，Sweden）分离外周血单个核细胞（PBMC）。用人IDO的酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司）检测PBMC中的IDO。

1.3统计学方法

数据用均数±标准差或中位数（25百分位, 75百分位) 表示。用SPSS19.0进行统计分析。两组间差别用χ2检验、独立样本t检验或Mann-Whitney U检验进行比较。用多变量Logistic回归分析模型评估发生血清固定的危险因素。定义双侧P＜0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1临床一般情况

无血清固定和血清固定患者的临床特征见表1。

2.2健康人群与梅毒患者PBMC中IDO蛋白水平

梅毒患者的IDO蛋白要显著高于健康对照[1.43(1.15, 1.95)比1.15(0.68, 1.26），P=0.024]（图2）。在24个月时有33例（18.5%）发生血清固定。发生血清固定患者的IDO蛋白要显著高于无血清固定的患者[2.26(1.89，2.50)比1.21(0.95，1.37)，P=0.002]（图2）。

表1　无血清固定和血清固定梅毒患者的临床特征

图2　研究对象的外周血IDO蛋白水平

2.2基线IDO中位荧光强度和血清固定风险的相关性

多变量Logistic回归分析纳入了4项变量，包括年龄、梅毒分期、治疗前RPR滴度和IDO蛋白水平分组（4等份后分为Q1～Q4组），4组患者在年龄、性别构成及疾病分期等变量上差异无统计学意义（P＞0.05）。经多变量校正后，与Q1组比较，Q4组与血清固定风险升高密切相关（表2）

表2　IDO水平分组和血清固定相关性的多变量Logistic回归分析

3　讨论

IDO是一种介导免疫耐受的关键分子。色氨酸是T淋巴细胞增殖所需的必需氨基酸，IDO过度表达/活化介导的色氨酸缺失能活化氨基酸敏感的GCN2信号通路，抑制免疫细胞增殖和分化、诱导凋亡和能量代谢障碍[8-10]。IDO包含一段免疫受体酪氨酸抑制基序，该结构进一步正反馈放大IDO介导的免疫耐受作用[11]。另外，色氨酸缺失和犬尿氨酸增加会诱导调节性T淋巴细胞生成、分化和成熟[12,13]，并阻抑这类免疫耐受细胞向其他T淋巴细胞亚型转化[13]。

本实验发现血清固定者的IDO水平显著高于无血清固定者。进一步在多变量Cox比例风险模型中分析了血清固定的风险，经年龄、分期和治疗前RPR滴度等影响血清固定的因素校正后，Q4组发生血清固定的风险较Q1组升高4倍。这些结果表明梅毒患者外周血的IDO水平升高和血清固定密切相关。

近年来，对于免疫耐受和梅毒血清固定之间的关系受到关注。国内学者用不同方法检测了梅毒患者PBMC中的调节性T淋巴细胞，结果发现血清固定患者该类细胞亚群要高于对照人群[14-16]。IDO是促进调节性T淋巴细胞的上游调节分子[12,13]，本文研究发现血清固定患者的IDO水平显著增高，由此推测IDO可能是通过上调调节性T淋巴细胞的方式介导血清固定的。

既往通过横断面研究的方式来观察血清固定的相关因素，例如调节性T淋巴细胞的水平[14-16]。这种设计不能说明血清固定是这些因素的原因或结局，因而不能提示这些相关因素是否为血清固定的原因。采用队列数据是本研究的一个优点。治疗前基线IDO升高发生在血清固定之前，因此可以提示IDO升高可能是导致血清固定的原因之一。

本文结果提示外周血IDO的基线水平和未来血清固定相关，提示IDO可能参与了梅毒血清固定和免疫耐受。如果这一机制被后续研究证实，将为解决梅毒治疗过程中的血清固定提供新的方向。

[1] Clement ME, Okeke NL, Hicks CB. Treatment of syphilis: a systematic review [J]. JAMA, 2014, 312(18):1905-1917.

[2] 龚向东, 岳晓丽, 滕菲, 等. 2000-2013年中国梅毒流行特征与趋势分析[J]. 中华皮肤科杂志, 2014, 47(5):310-315.

[3] Seña AC, Wolff M, Behets F, et al. Response to therapy following retreatment of serofast early syphilis patients with benzathine penicillin [J]. Clin Infect Dis, 2013,56(3):420-2.

[4] 赵玉磊, 苏晓红. 梅毒血清固定机制研究进展 [J] .实用皮肤病学杂志, 2014,7(2):122-125.

[5] Babolin C, Amedei A, Ozolins D, et al. TpF1 from Treponema pallidum activates inflammasome and promotes the development of regulatory T cells [J]. J Immunol, 2011, 187(3):1377-1384.

[6] Mellor AL, Munn DH. IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabolism [J]. Nat Rev Immunol, 2004, 4(10):762-774.

[7] 中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会性病学组. 梅毒血清固定临床处理专家共识 [J] .中华皮肤科杂志, 2015, 48(11):753-755.

[8] Ravishankar B, Liu H, Shinde R, et al. The amino acid sensor GCN2 inhibits inflammatory responses to apoptotic cells promoting tolerance and suppressing systemic autoimmunity [J] . Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(34):10774-10779.

[9] Eleftheriadis T, Pissas G, Antoniadi G, et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase increases p53 levels in alloreactive human T cells, and both indoleamine 2,3-dioxygenase and p53 suppress glucose uptake, glycolysis and proliferation [J]. Int Immunol, 2014, 26(12):673-684.

[10] Munn DH, Sharma MD, Baban B, et al. GCN2 kinase in T cells mediates proliferative arrest and anergy induction in response to indoleamine 2,3-dioxygenase [J]. Immunity, 2005, 22(5):633-642.

[11] Pallotta MT, Orabona C, Volpi C, et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase is a signaling protein in long-term tolerance by dendritic cells [J]. Nat Immunol, 2011, 12(9):870-878.

[12] Mezrich JD, Fechner JH, Zhang X, et al. An interaction between kynurenine and the aryl hydrocarbon receptor can generate regulatory T cells [J]. J Immunol, 2010, 185(6):3190-3198.

[13] Puccetti P, Grohmann U. IDO and regulatory T cells: a role for reverse signalling and non-canonical NF-kappaB activation [J]. Nat Rev Immunol, 2007, 7(10):817-23.

[14] 笪苏蓉, 陈官芝, 董娜, 等. 梅毒患者外周血特异性转录因子FOXP3 mRNA的表达 [J]. 中国中西医结合皮肤性病学杂志, 2015, 14(2):84-88.

[15] 赵建斌, 张明海, 马杰, 等. 梅毒血清固定患者外周血调节性T细胞/Th17细胞平衡的研究 [J]. 中华皮肤科杂志, 2012, 45(5):347-349.

[16] 刘百灵, 马杰, 张晓燕, 等. 梅毒血清固定患者外周血调节性T细胞和Th17细胞相关因子研究 [J]. 临床皮肤科杂志, 2014, 43(3):140-142.

（本文编辑耿建丽）

Relationship between peripheral indoleamine 2,3-dioxygenase and syphilis serofast: a prospective case-control study

HAN Li，XIE Zhen，WANG You-wei，et al
Dermatological department, Chengdu Second People's Hospital, Chengdu 610021, China

ObjectiveTo investigate the relationship between peripheral indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) and syphilis serofast. MethodsBased on a prospective case-control design, peripheral mononuclear cells of both serofast patients and healthy controls were isolated with ficoll-paque density gradient centrifugation and then the IDO level in PBMC was detected with ELISA. ResulsIDO level in syphilis patients was significantly higher than that in healthy controls. IDO level in serofast patients was significantly higher than that in nonserofast patients. A close relationship was revealed between serofast state and elevation of peripheral IDO level with multi-variable Logistic regression model. ConclusionIDO may be involved in immune tolerance and serofast of syphilis.

Syphilis；Serofast；Peripheral；Indoleamine 2,3-dioxygenase [J Pract Dermatol, 2016, 9(2):98-100]

R759.1

A

1674-1293(2016)02-0098-03

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160205

四川省卫生和计划生育委员会科研课题（090431）

610021，成都市第二人民医院皮肤科（韩莉）；四川省医学科学院四川省人民医院皮肤病性病研究所（谢震，王有为，刘杨英，万慧颖，周敏）

韩莉，主治医师，研究方向：感染性及免疫性皮肤病E-mail: 2188986240@qq.com

谢震，E-mail: xiezhen6289@126.com

（2015-12-19

2016-01-21）