筋骨草总黄酮对肾小球系膜细胞增殖的影响

南丽红，黄枚，赖文芳，贾铷，郑燕芳，杨澜，谢晴晴，彭卫华

（1.福建中医药大学药学院，福建福州350122；2.南京军区福州总医院，福建福州350025）

筋骨草总黄酮对肾小球系膜细胞增殖的影响

南丽红1，黄枚1，赖文芳1，贾铷1，郑燕芳1，杨澜1，谢晴晴1，彭卫华2

（1.福建中医药大学药学院，福建福州350122；2.南京军区福州总医院，福建福州350025）

目的观察筋骨草总黄酮对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响。方法LPS诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖，筋骨草总黄酮含药血清干预24、48 h后，用MTT法检测肾小球系膜细胞增殖情况，硝酸还原酶法、Elisa法分别检测培养液上清中NO、iNOS、MCP-1的含量。结果LPS能明显诱导肾小球系膜细胞增殖，培养液上清中NO、iNOS、MCP-1的含量明显高于正常对照组（P＜0.05或0.01）。10%、5%筋骨草总黄酮含药血清干预后OD值及培养液上清中NO、iNOS、MCP-1的含量均明显减少（P＜0.05或0.01）。结论筋骨草总黄酮能抑制LPS诱导的肾小球系膜细胞异常增殖和炎症介质NO、iNOS、MCP-1的释放。

肾小球系膜细胞；增殖；一氧化氮；一氧化氮合酶；单核细胞趋化蛋白-1；筋骨草总黄酮

肾小球系膜细胞（glomerularmesangialcell，GMC）是肾小球中功能最活跃的固有细胞，GMC异常增生以及由此而导致细胞外基质（extracelluarmatrix，ECM）的过量生成和聚积，是许多肾小球疾病常见的病理改变，并可最终引起肾小球硬化，是使肾小球疾病发展至终末期肾病的中心环节之一［1］，因此抑制GMC增生是治疗增生性肾脏病、防止病变恶化的关键环节。单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）与一氧化氮（nitric oxide，NO）是GMC激活后产生的2种炎症介质，一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）是NO合成反应的限速酶。其中诱导型NOS（inducible NOS，iNOS）在多种因素刺激下表达增加，导致NO过量生成，从而对系膜细胞产生病理性损伤。筋骨草（Ajuga decumbens Thunb）具有清热抗炎、抑制I型变态反应等作用，其有效成分为黄酮类化合物［2］。课题组前期研究［3-5］发现筋骨草总黄酮（total flavonoids of Ajuga，TFA）能明显抑制系膜增生性肾小球肾炎模型大鼠GMC增殖、减少细胞外基质积聚，具有促进肾小球病理改变恢复的作用，其作用与抗脂质过氧化损伤和抑制核转录因子-κB等表达有关。但TFA对GMC分泌NO、MCP-1的影响，目前未见相关报道。故我们通过LPS诱导体外大鼠GMC增殖模型，观察TFA含药血清对GMC增殖及分泌NO、iNOS、MCP-1的影响，为TFA在慢性肾脏疾病治疗中的应用提供实验依据。

1实验材料

1.1 实验动物和大鼠GMC清洁级SD雄性大鼠，体质量（200±20）g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，合格证号：0054797。大鼠HBZY-1肾小球系膜细胞株（无锡博慧斯生物医药科技有限公司）。

1.2 药物及试剂TFA（福建中医药大学药物制剂实验室）；PRMI 1640培养液（美国Hyclone公司）；胎牛血清（FBS，美国Hyclone公司）；胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；MTT（美国Amresco公司）；脂多糖（LPS，美国Biosharp公司）；DMSO（美国Amresco公司）；大鼠MCP-1 Elisa试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；NO、iNOS试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 仪器HERAcell 150型CO2培养箱（德国Heraeus公司）；ELX800型全自动酶标仪（美国BioTek公司）；TDL-5-A离心机（上海安亭科学仪器厂）；IX70倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；BS210S分析电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；Costar TM 96孔、24孔培养板（美国Corning公司）。

2实验方法

2.1 实验血清的制备SD大鼠随机分为空白血清组、TFA血清组。TFA血清组按前期动物实验的有效剂量2.16 g／kg，根据中药药理研究方法学，TFA溶液分2次给予灌胃，连续给药3 d，最后1 d 2次给药的间隔时间为2 h。于末次给药1 h后，腹主动脉取血，室温条件下静置4 h，3 000 r／min离心15 min，无菌条件下分离血清，置56℃恒温水浴箱中30 min作灭活处理，过滤除菌后，于-20℃冰箱

保存备用。空白血清组大鼠灌服等体积蒸馏水，与TFA血清组同时采血，提取血清方法同前。

2.2 细胞株的处理购买的大鼠HBZY-1肾小球系膜细胞株是以25 cm2／50 mL培养瓶运送，瓶内装满10%FBS的PRMI 1640培养液。收到细胞株，倒置相差显微镜下观察GMC贴壁生长良好，体积较大，呈梭形、三角形或不规则星形。将培养瓶置于CO2培养箱中静置24 h后，吸弃大部分培养液，继续置CO2培养箱中至细胞达70%～80%融合时进行传代，传代后的GMC常规培养。

2.3 分组与含药血清干预取对数生长期的大鼠GMC用0.25%胰酶消化后，用10%FBS的RPMI-1640培养液制成浓度为3×104个／mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔加细胞悬液100μL。CO2培养箱中孵育24 h，细胞完全贴壁之后，弃上清液，用1%FBS的PRMI 1640培养液继续培养24 h，使GMC同步生长于G0期。将96孔培养板中的大鼠GMC分为5组：①正常对照组：加入10%正常大鼠血清；②LPS组：加入LPS和10%正常大鼠血清；③10%TFA含药血清组：加入LPS和10% TFA含药血清；④5%TFA含药血清组：加入LPS和5%TFA含药血清；⑤2.5%TFA含药血清组：加入LPS和2.5%TFA含药血清。加入LPS的终浓度均为10μg／mL，血清终浓度不足10%的加入正常大鼠血清补齐。每组设6个复孔，每孔培养液200 μL，CO2培养箱中孵育24、48 h后，用MTT法检测各组大鼠GMC增殖情况。

2.4 细胞增殖检测含药血清干预24、48 h后，于每孔中加入5 mg／mL MTT溶液20μL，置CO2培养箱中继续孵育4 h后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μL DMSO，震荡10 min，使结晶充分溶解。选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值（OD值）。

2.5 NO、iNOS、MCP-1含量检测取对数生长期的大鼠GMC以1×105个／mL接种于24孔板中，1 mL／孔，培养24 h待细胞贴壁，用1%FBS的PRMI 1640培养液使GMC同步生长于G0后。分组及药物干预同2.3项，继续培养24、48h后，收集细胞培养液，离心，取上清液按试剂盒说明书，用硝酸还原酶法检测培养液上清中NO、iNOS含量，Elisa法检测培养液上清中MCP-1含量。

2.6 统计学处理用SPSS 15.0统计软件进行统计处理，数据属正态分布用x±s表示，多组间均数比较用单因素方差分析。

3实验结果

3.1 TFA含药血清组对大鼠GMC增殖影响见表1。

表1 TFA含药血清组对大鼠GMC增殖影响（x±s）

3.2 TFA含药血清组对培养液上清中NO、iNOS、MCP－1含量的影响见表2～表3。

表2 TFA含药血清组对培养液上清中NO、iNOS含量的影响（±s）

表2 TFA含药血清组对培养液上清中NO、iNOS含量的影响（±s）

注：与正常对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与LPS组比较，3）P＜0.05。

4讨论

4.1 在正常生理情况下，GMC保持极低的增殖活性。在病理状态下，多种损伤因子和有害物质均可刺激GMC活化，活化的GMC可异常增殖，自分泌炎症介质（如IL-1、TNF-α、NO、MCP-1等），这些合成、释放的炎症介质与GMC上特异受体结合，又促进GMC增殖和活化，形成了增强GMC活动的自我调节环。如此循环反复，使GMC持续受损，ECM聚积，最终导致终末期肾病。

4.2 NO是一个具有广泛生理活性的小分子，对肾

脏有明显的双重作用，在肾脏的生理和病理过程中起重要作用。在生理方面，对于肾血管的稳态调节、肾小管球间反馈、尿钠排泄、交感神经递质及肾素的释放和溶质及水在肾小管中的交换都发挥着重要作用［6］。若NO在短期内大量合成，则可导致肾组织损伤引发急性炎症反应［7］。NO可由NOS催化L-精氨酸与氧分子经多步氧化还原反应生成，NOS可分为2大类，一类是构成型NOS，包括内皮型NOS和神经元型NOS，是许多正常组织中基本存在的一种酶；另一类是iNOS，当细胞受到微生物内外毒素、炎症介质等刺激后才被激活表达，从而产生过量的NO，促进GMC增生和细胞外基质沉积［8-9］。MCP-1属于趋化因子CC亚家族的一员，可由肾组织内的系膜细胞合成和分泌，参与调节单核／巨噬细胞的浸润，在正常人组织中有少量表达。当GMC组织受损、缺氧、中毒、炎症等刺激下，MCP-1的表达增强，可趋化和激活单核／巨噬细胞至肾小球系膜区引起广泛的炎症浸润，促进GMC的活化和增生，使ECM聚集，加速肾小球硬化［10］。

表3 TFA含药血清对培养液上清中MCP-1含量的影响（±s）

表3 TFA含药血清对培养液上清中MCP-1含量的影响（±s）

注：与正常对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与LPS组比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01。

4.3 根据药理学原理，口服药物必须经由胃肠道吸收、体内代谢为活性代谢产物后发挥药理学作用。而血清药理学能客观地模拟了药物与机体相互作用过程，其血清所含的药物成分，也是经过体内一系列生物转化后，真正发挥作用的有效成分及药物作用下机体所产生的内生性有效成分，并且血清的理化性质与细胞所处的内环境相似［11－12］。因此，若TFA直接用于体外细胞，缺乏TFA在体内的代谢过程，并不能真实反映TFA在体内的药理作用。故本实验中采用了TFA含药血清，有助于进一步探讨TFA对GMC增殖的影响。

4.4 本实验采用LPS作为刺激因子，作用于体外培养的GMC，结果显示LPS能诱导GMC异常增殖，并可使NO、iNOS、MCP-1的释放量明显增加。TFA含药血清干预24、48 h后能明显抑制LPS诱导的GMC增殖，培养液上清中NO、iNOS、MCP-1含量亦明显减少，提示TFA可明显抑制LPS诱导的GMC异常增殖，并可明显减少炎症介质NO、iNOS、MCP-1的释放，从而有利于减轻GMC的持续受损，延缓肾小球疾病的慢性进展。

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R285.5

A

1000-338X（2016）04-0034-03

2016－05－22

福建省科学技术厅自然科学基金资助课题（2014J05094）

南丽红（1974—），女，副教授，主要从事中药药理研究。

彭卫华（1970—），男，副主任医师。E-mail：pwhua7011@ aliyun.com