外源性硫化氢对人宫颈癌HeLa细胞的影响及作用机制

冯晓冰，陈建国，杨翼鹰，陈景福，甄育兰

(1高州市第二人民医院，广东高州525200；2广东省人民医院；3中山大学附属第一医院；4广东医学院附属医院)



外源性硫化氢对人宫颈癌HeLa细胞的影响及作用机制

冯晓冰1，陈建国2，杨翼鹰3，陈景福3，甄育兰4

(1高州市第二人民医院，广东高州525200；2广东省人民医院；3中山大学附属第一医院；4广东医学院附属医院)

目的 探讨外源性硫化氢对人宫颈癌Hela细胞的影响及其作用机制。方法 将培养好的人宫颈癌HeLa细胞随机分为6组，正常对照组：正常培养，不作任何处理；NaHS组：加入400 μmol/L的NaHS；NaHS+PDTC组：加入400 μmol/L的NaHS和100 μmol/L的PDTC(NF-κB通路抑制剂)；NaHS+NS-398组：加入400 μmol/L的NaHS和10 μmol/L的NS-398(COX-2通路抑制剂)；PDTC组：加入100 μmol/L的PDTC；NS-398组：加入10 μmol/L的NS-398。各组干预24 h，用CCK-8法测定细胞相对存活率，用ELISA法检测细胞培养上清液中血管内皮生长因子(VEGF)水平，用Transwell小室实验检测细胞迁移能力，用Western blotting法检测细胞内Caspase-1、Caspase-12、p-NF-κB p65和COX-2蛋白表达。结果 干预24 h，与正常对照组、NaHS+PDTC组、NaHS+NS-398组比较，NaHS组细胞相对存活率、培养上清液VEGF水平、细胞迁移能力及NF-κB p65(除外NaHS+NS-398组)、COX-2蛋白表达升高，Caspase-1、Caspase-12蛋白表达降低(P均<0.05)；PDTC组、NS-398组以上指标与正常对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 外源性硫化氢可通过激活NF-κB/COX-2信号传导通路促进人宫颈癌HeLa细胞增殖、新生血管形成、细胞迁移。

宫颈肿瘤；硫化氢；HeLa细胞；核因子κB；环氧合酶2

宫颈癌是常见妇科恶性肿瘤之一，对女性健康危害极大，因此对宫颈癌的病因和发病机制进行研究尤为重要。核因子κB(NF-κB)是人体内重要的转录调控因子之一，其在宫颈病变组织中的过表达可促使该部位从炎症反应向宫颈癌转化[1]。环氧合酶2(COX-2)在肿瘤病理状态下可被诱导表达，在宫颈癌肿瘤组织中COX-2表达高于宫颈正常组织[2]。研究发现，NF-κB可上调多种肿瘤组织中的COX-2基因表达水平，诱导血管生成和促进肿瘤的转移[3～5]。然而在宫颈癌的病理过程中，NF-κB通路激活与COX-2表达是否存在相关关系仍未得到证实。硫化氢(H2S)是体内重要的气体信号分子，多项研究证实H2S有助于肿瘤细胞的生长、增殖、迁移和侵袭[6～9]。研究发现，外源性H2S可促进肝癌细胞或胶质瘤细胞的增殖、血管形成、迁移以及抗肿瘤细胞凋亡[10，11]，但目前外源性H2S对宫颈癌细胞的影响及机制仍无相关报道。2015年5月～2016年5月，本研究观察外源性H2S对宫颈癌HeLa细胞的影响，并探讨其与NF-κB/COX-2通路的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 人宫颈癌HeLa细胞株，由中山大学实验动物中心细胞库提供。细胞计数试剂盒8(CCK-8)，购自Dojindo Lab公司；NaHS(H2S的供体)、Hoechst 33258、NF-κB通路抑制剂(PDTC)、COX-2通路抑制剂(NS-398)，购自Sigma-Aldrich公司；RPMI1640培养基、特级胎牛血清(FBS)，购自Gibco BRL。抗Caspase-1抗体、抗Caspase-12抗体、抗COX-2抗体和抗NF-κB p65抗体，购自Cell Signaling technology Inc。ELISA试剂盒，购自R&D公司；Transwell小室，购自Corning公司。

1.2 细胞培养与分组 HeLa细胞置于RPMI1640培养基(含10%特级FBS)中培养，并置于5% CO2、37 ℃的恒温箱中。将细胞分为6组，正常对照组：正常培养，不作任何处理；NaHS组：加入终浓度为400 μmol/L的NaHS；NaHS+PDTC组：加入终浓度为400 μmol/L的NaHS和终浓度为100 μmol/L的PDTC；NaHS+NS-398组：加入终浓度为400 μmol/L的NaHS和终浓度为10 μmol/L的NS-398；PDTC组：加入终浓度为100 μmol/L的PDTC；NS-398组：加入终浓度为10 μmol/L的NS-398。

1.3 细胞相对存活率测定 采用CCK-8法。干预24 h，将细胞接种于96孔板中，于每孔中加入CCK-8 10 μL和RPMI1640培养基90 μL，轻摇，37 ℃孵育1.5 h，用酶标仪检测450 nm波长处各孔光密度值。取5孔光密度值的平均数，计算细胞相对存活率。细胞相对存活率(%)=实验组光密度值/对照组光密度值×100%。实验重复3次，取平均值。

1.4 细胞培养上清液中血管内皮生长因子(VEGF)检测 采用ELISA法。干预24 h，取细胞培养上清液用ELISA法测定VEGF水平。根据ELISA试剂盒说明书进行操作，终止反应。用酶标仪检测450 nm波长处各孔光密度值，用标准物浓度与光密度值的标准曲线直线回归方程，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为VEGF的实际水平。实验重复3次。

1.5 细胞迁移能力检测 采用Transwell小室实验。干预24 h，将Transwell小室置于24孔板，下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基800 μL，上室加含1%胎牛血清的RPMI1640培养基300 μL，含对数生长期的HeLa细胞2×105。培养48 h，将小室取出并用PBS清洗，对上室没有穿过的细胞用湿棉签轻轻擦掉，以100%结晶紫(无水甲醇配制)染色，在200倍显微镜下从小室的上、下、左、右、中共选取5个视野对穿膜细胞进行计数。实验重复3次，取平均值。

1.6 细胞内p-NF-κB p65、COX-2及Caspase-1、Caspase-12蛋白表达检测 采用Western blotting法。干预24 h，弃培养基，用预冷的PBS冲洗3次，加入裂解液，4 ℃静置30 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDS-PAGE分离后，转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭60 min，随后分别加入抗p-NF-κB p65抗体(1∶1 000)、抗t-NF-κB p65抗体(1∶1 000)作对照、抗COX-2抗体(1∶1 000)、抗Caspase-1抗体(1∶1 000)、抗Caspase-12抗体(1∶1 000)，4 ℃过夜，用TBST洗3次，10 min/次。将PVDF膜用发光试剂ECL显色，暗室曝光到X线片上，凝胶成像系统扫描分析结果。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值，p-NF-κB p65蛋白相对表达量=p-NF-κB p65条带灰度值/t-NF-κB p65条带灰度值。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组细胞相对存活率比较 干预24 h，正常对照组、NaHS组、NaHS+PDTC组、NaHS+NS-398组、PDTC组、NS-398组细胞相对存活率分别为(100±0.00)%、(132.64±6.39)%、(112.05±7.61)%、(113.16±5.95)%、(98.79±3.45)%、(99.61±6.75)%。与其他各组比较，NaHS组细胞相对存活率升高(P均<0.05)，PDTC组、NS-398组细胞相对存活率与正常对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.2 各组培养上清液VEGF水平比较 干预24 h，正常对照组、NaHS组、NaHS+PDTC组、NaHS+NS-398组、PDTC组、NS-398组培养上清液VEGF水平分别为(100.00±0.00)%、(193.84±8.43)%、(149.13±14.89)%、(138.16±6.52)%、(97.12±6.67)%、(98.97±10.10)%。与其他各组比较，NaHS组培养上清液VEGF水平升高(P均<0.05)，PDTC组、NS-398组培养上清液VEGF水平与正常对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.3 各组迁移能力比较 正常对照组、NaHS组、NaHS+PDTC组、干预24 h，NaHS+NS-398组、PDTC组、NS-398组穿膜细胞数分别为(9.33±3.06)、(44.33±8.33)、(23.00±2.65)、(27.67±3.21)、(11.67±3.51)、(8.33±5.86)个/视野。与其他各组比较，NaHS组穿膜细胞数增多(P均<0.05)，PDTC组、NS-398组穿膜细胞数与正常对照组比较差异无统计学意义(P均>0.05)。2.4 各组p-NF-κB p65、COX-2及Caspase-1、Caspase-12蛋白表达比较 见表1。

表1 各组p-NF-κB p65、COX-2及Caspase-1、Caspase-12蛋白表达比较

注：与NaHS组相比，△P<0.05。

3 讨论

宫颈癌是严重危害女性健康的恶性肿瘤之一[12,13]。越来越多的研究表明，宫颈癌的发生发展是一个包括HPV感染和其他协同因素共同作用的复杂过程。某些信号分子、转录因子或者信号传导通路的活性改变在宫颈癌的发病机制中可能发挥了重要作用[14,15]。因此，本研究在既往研究基础上进一步探究宫颈癌发生发展的相关分子生物学机制，以期为预防及治疗宫颈癌提供新的思路。

作为体内重要信号分子之一，H2S拥有多种生物活性，包括促进血管生成[16]、抗氧化[17]和抗炎症反应[18]等。内源性H2S也参与多种肿瘤的病理生理过程[19～21]。我们在前期研究中证实，外源性H2S能够作用于肝癌细胞和神经胶质瘤细胞，促进肿瘤细胞增殖、减少肿瘤细胞凋亡、促进新生血管形成及增强肿瘤细胞迁移浸润能力[10,11]。然而，目前关于H2S与宫颈癌发生发展之间的联系仍无相关报道。本实验首次证实了外源性H2S可以提高宫颈癌HeLa细胞存活率、减少其凋亡和促进其迁移，还可以上调HeLa细胞VEGF的分泌水平。VEGF可以由多种肿瘤(如胃癌、肝癌、宫颈癌和肺癌等)细胞产生，是重要的促血管生成因子之一，能增加血管通透性，促进血管内皮细胞增殖，从而促进新生血管形成[22,23]。因此，外源性H2S可能通过促进新生血管形成从而提高宫颈癌细胞的血运功能。以上研究结果与我们前期关于外源性H2S对肝癌细胞和胶质瘤细胞等肿瘤细胞的生理功能影响的研究[10,11]结果一致。

NF-κB属于Rel蛋白家族，该蛋白家族在哺乳动物体内有5个成员：ReA(p65)、ReB、c-Rel、p105/p50(NF-κB1)和p100/p52(NF-κB2)，它们N末端的Rel同源结构域含有使NF-κB形成同源或异源二聚体、核定位信号及识别DNA相应位点的序列。相关研究指出，NF-κB在宫颈癌病变组织中表达升高，并且与宫颈癌的分化程度、侵袭转移和预后密切相关，提示NF-κB激活在宫颈癌的发生发展过程中有重要作用[15,24]。Kuncharin等[1]在研究宫颈癌细胞系时发现，Notch信号通路相关信号分子可通过对NF-κB通路的激活，从而提高肿瘤细胞的增殖能力和抑制肿瘤细胞凋亡。COX又称前列腺素类过氧化物合成酶，可催化花生四烯酸转化为前列腺素类物质。COX-2在大多数组织中可被多种胞外刺激所诱导表达，从而成为炎症过程中重要的诱导酶。多种肿瘤组织中的COX-2表达与肿瘤的进展有关。现已发现，与正常宫颈表皮组织相比，宫颈癌组织中的COX-2的表达明显升高，并且与VEGF的表达水平呈正相关，而两者的高表达与宫颈癌细胞的浸润和侵袭密切联系[2]。本研究测定细胞的NF-κB p65的磷酸化水平和COX-2的表达水平，发现外源性H2S作用于HeLa细胞可以明显促进NF-κB p65的磷酸化，并且提高COX-2的表达水平。为了进一步探究外源性H2S对HeLa细胞的上述生理作用的相关分子机制，本研究分别观察PDTC(NF-κB通路抑制剂)和NS-398(COX-2通路抑制剂)对外源性H2S作用于HeLa细胞产生相关通路蛋白表达水平的影响以及保护HeLa细胞和促进细胞新生血管形成作用的影响，发现PDTC能减少外源性H2S对NF-κB通路磷酸化蛋白的激活作用，而NS-398能降低外源性H2S对COX-2通路蛋白表达的促进效应。而且，PDTC和NS-398均可对抗外源性H2S对HeLa细胞的毒性保护、抗凋亡、促进新生血管形成和促进细胞迁移的作用。这提示，外源性H2S对HeLa细胞的相关生理功能可能与NF-κB信号通路和COX-2信号通路的激活有关。最为重要的是，本研究发现，应用NaHS与NS-398共处理HeLa细胞后，p-NF-κB p65的表达与NaHS组并无明显差异；而NaHS和PDTC共处理HeLa细胞后，COX-2的表达水平与NaHS处理组相比则显著下降。进一步证实了COX-2是宫颈癌细胞中NF-κB信号通路的下游信号分子，抑制NF-κB信号通路活性可以明显下调COX-2蛋白的表达，抑制COX-2表达对NF-κB信号通路表达则无明显负反馈作用。而H2S可能是通过NF-κB信号通路调节COX-2的表达，从而对HeLa细胞发挥相关的生理功能。这与此前相关报道结果相一致[3～5]。

本研究以宫颈癌HeLa细胞为研究对象，首次证实了外源性H2S可以减少HeLa细胞毒性作用、提高细胞存活率、抗细胞凋亡、促进细胞的新生血管生成及细胞迁移。而且这些生理功能可能是通过NF-κB/COX-2信号通路的激活而实现；而阻断该通路的激活则可以抑制H2S对HeLa细胞的上述生理作用。由于H2S是体内重要的活性气体分子，所以这可能是宫颈癌发病的重要生理机制之一。随着分子生物学进一步发展，H2S促进子宫颈癌发生发展的生理机制将会更加明确，这将为临床治疗宫颈癌提供新的理论基础和科学依据。

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陈建国(E-mail:chenjianguo_gz@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.010

R737.33

A

1002-266X(2016)37-0031-04

2016-06-03)