盐酸法舒地尔对大鼠心肌损伤组织中Cx43表达的影响

郑鹏飞，巫相宏，黄文，马国添，闭奇

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)



·基础研究·

盐酸法舒地尔对大鼠心肌损伤组织中Cx43表达的影响

郑鹏飞，巫相宏，黄文，马国添，闭奇

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

目的 观察盐酸法舒地尔(HF)对大鼠心肌损伤组织中缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响，探讨其保护心肌组织的机制。方法 将24只SD大鼠随机分成空白组、脂多糖(LPS)组、LPS+HF组各8只。LPS+HF组腹腔注射HF 30 mg/kg预处理0.5 h后，尾静脉注射LPS 1 mg/kg；LPS组腹腔注射HF等量生理盐水预处理0.5 h后，尾静脉注射LPS 1 mg/kg；空白组腹腔注射HF等量生理盐水预处理0.5 h后,尾静脉注射LPS 等量生理盐水。尾静脉注射后6 h处死大鼠，取左心室心肌组织，分别采用Western blot法、荧光定量PCR法检测心肌组织中的RhoA/ROCK信号通路关键蛋白ROCK1、Cx43 蛋白及mRNA。结果 与空白组比较，LPS组ROCK1 mRNA及蛋白表达增加(P均<0.01)，Cx43 mRNA及蛋白表达降低(P均<0.01)；与LPS组比较，LPS+HF组ROCK1 mRNA及蛋白的表达下降(P均<0.01)，Cx43 mRNA及蛋白表达增加(P均<0.01)。结论 盐酸法舒地尔通过RhoA/ROCK信号通路调节心肌组织中Cx43的表达，从而减轻LPS诱导的心肌损伤。

心肌损伤；脂多糖；法舒地尔；Rho信号通路；ROCK1蛋白；缝隙连接蛋白43；大鼠

细胞缝隙连接是心肌细胞间的电连接形式，调控细胞新陈代谢、内环境稳态、增殖和分化等生理过程。缝隙连接蛋白43(Cx43)是构成心室间隙连接的主要结构蛋白，是心肌细胞间进行小分子量物质通讯和电传导的基础，其正常表达和分布是心脏正常电生理活动和协调舒缩的重要保证[1]。已有报道，Cx43参与了急慢性心肌缺血、心力衰竭、心律失常等疾病的发生发展过程[2]。研究指出，RhoA/ROCK通路在心血管疾病的发生发展过程中起关键作用[3]，ROCK1是该通路的关键酶。盐酸法舒地尔(HF)是惟一种应用在临床上的Rho激酶抑制剂。已有报道，HF可能阻止和逆转肺动脉高压、右心室肥大、心肌细胞损伤的发展[4]。然而，HF改善心肌功能障碍的作用机制尚不清楚。2015年3～12月，本实验采用脂多糖(LPS)诱导SD大鼠的急性心肌损伤模型来探讨HF的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SD大鼠，雄性，5周龄，体质量250 g，购自广西医科大学动物实验中心。LPS(美国Sigma公司)，HF(山西普德药业股份有限公司)；羊抗兔荧光二抗(美国Licor 公司)，兔抗鼠ROCK1抗体(英国Abcam公司)，兔抗鼠Cx43抗体及(SAB公司)，兔抗鼠GAPDH抗体(Cell Signaling Technology 公司)；BCA检测试剂盒(中国碧云天公司)，逆转录试剂盒、Taq PCR Master Mix ki(Takara 公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组造模与干预处理 24只SD大鼠随机分成3组：空白组、LPS组、LPS+HF组。LPS+HF组腹腔注射HF 30 mg/kg预处理0.5 h后，尾静脉注射LPS 1 mg/kg；LPS组腹腔注射HF等量生理盐水预处理0.5 h后，尾静脉注射LPS 1 mg/kg；空白组腹腔注射HF等量生理盐水预处理0.5 h后,尾静脉注射LPS 等量生理盐水。

1.2.2 心肌组织取材 尾静脉注射后6 h，大鼠行腹腔麻醉；取左心室组织，以PBS洗净，-80 ℃冻存备用。

1.2.3 心肌组织ROCK1、Cx43蛋白检测 采用Western blot 法。低温下将心肌组织剪碎，加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂 PMSF)快速匀浆，裂解；离心提取组织总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度，100 ℃ 变性 5 min。每孔30 μg蛋白行 SDS-PAGE 电泳，湿转至PVDF膜，洗膜 3×5 min；5%脱脂奶粉室温封闭 1 h，洗膜 3×5 min；一抗 4 ℃孵育过夜(ROCK1抗体，1∶1 000；Cx43抗体，1∶500)，洗膜 3×5 min；荧光二抗(1∶10 000)室温下避光孵育 1 h。使用Odyssey双色红外激光成像系统扫描，并以目的蛋白与内参 GAPDH灰度比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.2.4 心肌组织ROCK1、Cx43 mRNA检测 采用实时荧光定量PRC法。TRIzol法提取心肌组织总RNA，分光光度计测定RNA的总浓度。按逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA，应用ABI Prism Step One序列检测系统进行PCR扩增(反应体系20 μL)。95 ℃预变性30 s后进行PCR反应，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s,共进行40个循环。引物序列：Cx43上游引物5′-GCTCCACTCTCGCCTATGTC-3′，下游引物5′-TAGTTCGCCCAGTTTTGCTC-3′；ROCK1上游引物5′-AAGAGAGTGATATTGAGCAGTTGCG-3′，下游引物5′-TTCCTCTATTTGGTACAGAAAGCCA-3′；GAPDH上游引物5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物5′-CAAAGAGGGTGGAGAGCAAG-3′。用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量，每个样品通过管家基因GAPDH作为内参使目标基因标准化。

2 结果

2.1 各组心肌组织中ROCK1、Cx43蛋白相对表达量比较 与空白组比较，LPS组中ROCK1蛋白表达显著上升(P<0.01)，Cx43蛋白表达显著下降(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+HF组ROCK1蛋白表达显著下降(P<0.01)，Cx43蛋白表达显著上升(P<0.01)。见表1。

表1 各组心肌组织中ROCK1、Cx43蛋白 相对表达量比较±s)

注：与空白组比较，*P<0.01；与LPS组比较，#P<0.01。

2.2 各组心肌组织中ROCK1、Cx43 mRNA相对表达量比较 与空白组比较，LPS组ROCK1 mRNA表达显著上升(P<0.01)，Cx43 mRNA表达显著降低(P<0.01)；与LPS组比较，LPS+HF组ROCK1 mRNA的表达显著下降(P<0.01)，Cx43 mRNA表达显著上升(P<0.01)。见表2。

3 讨论

近年来，心血管疾病已经成为影响人类健康的重要因素之一,动脉粥样硬化、心肌梗死及心力衰竭等都能导致心肌功能障碍、心肌收缩不良、心室重构及各种心律失常。大量的实验和临床研究指出，RhoA/ROCK通路在心血管疾病的发生发展过程中起关键作用。RhoA/ROCK参与了血管平滑肌细胞的收缩、内皮功能障碍、炎症细胞的聚集和血管重构及心室重构等过程[3]。

表2 各组心肌组织中ROCK1、Cx43 mRNA 相对表达量比较±s)

注：与空白组比较，*P<0.01；与LPS组比较，#P<0.01。

HF是目前惟一一种应用在临床上的Rho激酶特异性抑制剂，为一种新型异喹啉磺胺衍生物，可以通过与 ATP竞争Rho激酶催化区的 ATP结合位点而阻断Rho激酶的活性，同时亦可以抑制ROCK1 mRNA及蛋白的表达[5，6]。在临床上，HF对血管痉挛性心绞痛[7]、稳定型劳力性心绞痛[8]等患者有着显著的疗效。研究指出，Rho激酶活化增加有助于肥胖引起的心脏功能障碍和胰岛素抵抗[9]。Rho激酶的表达和活性升高有助于糖尿病心肌病的发展[10]；RhoA/ROCK通路有助于缺血性损伤或持续性应激诱导的心肌重塑，从而导致心功能失代偿性心力衰竭[11]。HF可以通过抑制ROCK1的表达而明显改善心肌收缩功能，减少心肌纤维化[12]。目前，Rho激酶通路已经成为治疗心血管疾病的一个新靶点。本实验采用LPS诱导SD大鼠的急性心肌损伤模型来探讨HF改善心肌功能障碍的作用机制。结果发现，LPS处理SD大鼠6 h后，其心肌组织中ROCK1的表达水平显著上升，HF可以降低ROCK1的表达水平，可见，HF通过抑制Rho信号通路而发挥作用。研究指出，在肺静脉血管内皮细胞中，与Cx43调节主要相关的通路是RhoA/ROCK信号通路而不是PKC信号通路,ROCK1参与对Cx43的调节[13]。而在心肌细胞中，HF是否通过Rho信号通路调节Cx43的表达，这一机制尚不清楚。

缝隙连接介导的心肌细胞间通讯在心肌功能障碍发生发展过程中起关键作用，心肌细胞间信息的正常传递主要通过缝隙连接来实现。正常心肌细胞Cx43主要表达于相邻细胞的连接处及闰盘部位。Cx43是心室肌细胞缝隙连接的主要结构蛋白和心肌电生理的主要决定因素，是心肌细胞间进行小分子量物质通讯和电传导的基础。其表达正常和分布是心脏正常电活动维持和舒缩功能协调的必要条件[1]。研究指出，破坏心肌细胞间正常分布的Cx43，能增加室性心律失常和猝死的发生[14]；折返性心律失常及慢性肥厚心脏传导异常，与Cx43的表达降低有关[15]；心室肌细胞中Cx43的下调和重新分布，有助于心室结构重塑及左心室纤维化的发生[16]；心肌缺血或者慢性肥厚的心室肌细胞中，Cx43表达降低[17]。缺氧可下调乳鼠心肌细胞Cx43表达量，导致心肌细胞缝隙连接重构，诱发恶性心律失常[18]。研究指出，LPS损伤心肌细胞后，心肌细胞中的Cx43表达会显著降低，从而影响心肌细胞正常功能的发挥[19]。本实验发现，在LPS作用SD大鼠6 h后，心肌组织中Cx43的表达显著降低，而HF预处理0.5 h可以干预上述结果。因此，我们认为HF通过Rho信号通路调节损伤的心肌组织中Cx43表达，从而改善心肌功能障碍。

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国家自然科学基金资助项目(81360057)。

巫相宏(E-mail： whw780@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.38.008

R966

A

1002-266X(2016)38-0026-03

2016-04-23)