3月龄草鱼种免疫器官组织学及其免疫后免疫基因的转录差异

张鹏英，常藕琴，石存斌 ，吴淑勤

(1. 中国水产科学研究院珠江水产研究所，广东省水产动物免疫技术重点实验室，农业部渔药创制重点实验室，广州 510380;2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)



3月龄草鱼种免疫器官组织学及其免疫后免疫基因的转录差异

张鹏英1，2，常藕琴1，石存斌1，吴淑勤1

(1. 中国水产科学研究院珠江水产研究所，广东省水产动物免疫技术重点实验室，农业部渔药创制重点实验室，广州 510380;2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

为研究处于同一时期但养殖条件不同的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)鱼体规格与发育状态间是否具有一致性，观察压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏的显微结构，并对压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼进行腹腔注射疫苗处理，实时荧光定量PCR检测免疫7 d后、14 d后各期草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏中IgM与MHCⅠ的表达量。结果显示，压塘3月龄草鱼各组织发育较普通3月龄草鱼迟缓。压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼在免疫后，头肾、中肾、肠道与脾脏中IgM和MHCⅠ的表达量均有上升，且IgM与MHCⅠ的相对表达量峰值均出现在普通3月龄草鱼免疫14 d后的中肾中(IgM为74.51倍；MHCⅠ为56.02倍。结果表明，草鱼出血病活疫苗可以增强草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏中IgM和MHCⅠ的表达，且在3月龄时期进行注射免疫效果最佳。

草鱼(Ctenopharyngodonidellus)；免疫器官组织学；疫苗免疫；IgM；MHCⅠ

草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是中国淡水养殖的四大家鱼之一，但在养殖过程中的“四病”(赤皮病、烂鳃病、肠炎病、出血病)一直制约着草鱼养殖的发展[1]。其中草鱼出血病是流行地区最广、季节最长、危害最大的一种流行病，该病由草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus， GCRV)引起，是鱼种培育阶段的最大病害[2]。利用免疫手段提高鱼类获得性免疫力可以防治鱼类疾病[3]，预防草鱼出血病最有效的方法是接种疫苗[4]，实践表明，草鱼经免疫后成活率大大提高，目前中国每年有数十亿草鱼苗种受益于疫苗免疫[5]。鱼类疫苗的免疫接种方法有注射、浸泡、口服和基因枪接种4 种方式，其中注射免疫能使鱼类免疫接种取得较好效果[6]。有研究表明，草鱼出血病疫苗能够在一定时间内起到抗感染的免疫效果[7]。通常情况下，鱼种在培育到一定规格后，会进行分塘养殖以降低养殖密度，促进鱼种生长。然而近年来，许多养殖户为了追求经济效益，将部分鱼种压塘养殖以错峰销售。压塘鱼由于养殖密度过大，投喂饲料不足等问题，比正常养殖鱼的生长发育迟缓。养殖过程中一般3月龄鱼进行免疫对鱼病有较好的预防效果。压塘和正常养殖3月龄鱼头肾、中肾、肠道、脾脏等免疫组织结构及免疫相关因子间是否存在差异，可否同期免疫，尚未见相关资料和报道。本研究使用组织切片和实时荧光定量PCR技术对压塘和正常养殖3月龄鱼免疫器官组织学和免疫相关基因进行研究，为进一步探讨草鱼出血病活疫苗在草鱼出血病的防治中的使用时间与免疫组织结构成熟度和免疫时机的关系，为免疫器官发育和免疫组织学研究提供基础资料，为草鱼疫苗更好地发挥作用提供科学依据，对疫苗应用、免疫防治具有重要的实践指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用鱼均来自广东省清远市百容水产良种有限公司，压塘3月龄草鱼体长( 4.6±0.6) cm，体质量(1.0±0.5) g，普通3月龄草鱼体长(15.4±0.9) cm，体质量( 47.4±18.1) g。

反转录试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit 、荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex Taq II 和RNAiso Plus均购自TaKaRa 公司、RNAhold 购自北京全氏金生物公司，荧光定量PCR 仪为美国Applied Biosystems 公司产品、台式冷冻离心机为上海人和科学仪器有限公司产品，PCR引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，注射用疫苗草鱼出血病减毒活疫苗(GCHV-892株)由中国水产科学研究院珠江水产研究所疫苗工程中心馈赠。

1.2 实验方法

组织取样 取压塘3月龄草鱼和普通3月龄草鱼的头肾、中肾、肠道(肠后段)和脾脏组织。组织大小和形状允许的，以1.5 cm×1.5 cm×0.2 cm的规格取材，体积过小的则整体取出。取材完成后立即置于Bouin′s液中进行固定，24 h后将组织块置于70 %酒精中。

常规石蜡切片制作 固定完成后，常规脱水透明，石蜡包埋后，3 μm纵向连续切片，切片烘干后进行H.E 染色，中性树胶封片。然后将切片置于LEICA DM750 型显微镜下观察，LEICA ICC50 HD 型摄像头下拍照。

草鱼的免疫 选取健康的压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼各30条进行疫苗腹腔注射。压塘3月龄草鱼每尾注射100 μL、普通3月龄草鱼每尾注射150 μL。

常规石蜡切片制作 组织用Bouin′s液固定完成后，常规脱水透明，石蜡包埋后，3 μm纵向连续切片，切片烘干后进行H.E 染色，中性树胶封片。然后将切片置于LEICA DM750 型显微镜下观察，LEICA ICC50 HD 型摄像头下拍照。

总RNA 的提取以及cDNA制备 免疫7 d和14 d后，各组实验鱼分别取适量的头肾、中肾、肠道和脾脏组织，按Trizol法提取总RNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量和完整性，用微量分光光度计测定RNA 样品的浓度。再按照反转录试剂盒PrimeScript RT Reagent Kit说明书将总RNA样品反转录为cDNA用于荧光定量PCR扩增模板。

实时荧光定量PCR引物设计 在NCBI 上查找草鱼β-actin、IgM和MHCⅠ的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如表1 所示。

表1 β-actin、IgM和MHCⅠ基因引物

草鱼IgM和MHCⅠ基因组织表达分析 反转录的cDNA 作模板进行实时荧光定量PCR，每个样品3 个平行。按照荧光定量试剂盒步骤在ABI 7500 ( Applied Biosystems) 实时荧光定量PCR 仪上进行荧光定量PCR 检测，反应体系：SYBRPremix ExTaqTM Ⅱ( 2×) 5 μL，ROX Reference Dye II(50×) 0.2 μL，10 μmol /L 的上下游引物各0.2 μL，cDNA 1μL，ddH2O 3.4 μL，反应总体积为10 μL。反应条件:95 ℃ 预变性30 s，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，扩增40 个循环， 60 ℃延伸时采集荧光信号，反应结束后对扩增产物进行溶解曲线分析，以确保特异性扩增。采用2- ΔΔCt法计算样品中IgM和MHCⅠ基因mRNA 的相对表达量。

2 结果

2.1 组织学观察

2.1.1 头肾的观察

压塘3月龄草鱼头肾中可观察到分化明显且不规则分布的粒细胞和大量淋巴细胞，同时还能观察到相间分布的微静脉和血窦。淋巴细胞不规则分布，仍有肾小管结构(见图版Ⅰ-1)。普通3月龄草鱼头肾中未见肾小管，头肾实质中无肾单位，淋巴细胞有聚集分布现象，可观察到动脉、静脉和丰富的血窦，窦腔较大，内含大量血细胞，静脉与窦腔相通。头肾中还分散有肾上腺细胞群。此时的头肾区域间界限明显，可观察到淋巴细胞聚集区和肾上腺内分泌组织区(见图版Ⅰ-2)。

2.1.2 中肾的观察

压塘3月龄草鱼中肾可观察到肾小管间有淋巴组织分布，这些淋巴组织主要由淋巴细胞、黑色素巨噬细胞、红细胞和各种粒细胞组成。可识别出近端小管与远端小管。近端小管长且弯曲，管壁细胞排列紧密，细胞核呈柱状或梭形，强嗜碱性，管腔内有浓密的嗜酸性刷状缘，对管腔有闭锁作用；远端管多呈圆形，管壁细胞排列紧密，细胞核呈椭圆形，嗜碱性，管腔内光滑无刷状缘(见图版Ⅰ-3)。普通3月龄草鱼的中肾可观察到大量的淋巴组织与肾小管相间分布，这些淋巴组织中已可分辨出大淋巴细胞和小淋巴细胞。同时黑色素巨噬细胞、红细胞和各种粒细胞数量也较多，肾小管管径已明显扩大，管壁细胞的核质比已显著减小，细胞质嗜酸性明显。近端小管与远端小管管腔也有扩大，近端小管管腔内刷状缘对管腔的闭锁程度较压塘3月龄草鱼近端小管小，为亚成熟肾小管。此时，部分肾单位开始出现和成体相同的细胞形态。未见肾小球(见图版Ⅰ-4)。

2.1.3 肠道的观察

压塘3月龄草鱼肠腔内黏膜褶高约占肠腔半径的1/2，排列不紧密;肠腔内黏膜层较薄，由单层柱状上皮细胞和杯状细胞组成，上皮细胞间有H.E深染为紫蓝色的黏液细胞分布，细胞核椭圆形，中位或基位；黏膜下层由比较疏松的结缔组织组成;外被平滑肌构成的肌肉层。肠道固有层中含有大量的粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞，沿黏膜褶弯曲方向聚集(见图版Ⅰ-5)。普通3月龄草鱼肠腔内黏膜皱褶丰富，腔内黏膜层变厚，肠上皮为单层柱状上皮，细胞高柱状，上皮细胞间有黏液细胞，高柱状的上皮细胞游离面有密集排列的微绒毛组成的纹状缘。肠道黏膜组织中的粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞数量进一步增加，散布于黏膜褶中(见图版Ⅰ-6)。

2.1.4 脾脏的观察

压塘3月龄草鱼脾脏有集中分布在中部的黑色素巨噬细胞中心结构，血管横跨整个脾脏，位于脾脏的中央，管外有大量嗜碱性细胞分布。微血管发达，有大量红细胞、淋巴细胞和粒细胞相间分布，还可观察到少量巨噬细胞结构(见图版Ⅰ-7)。普通3月龄草鱼脾脏中部分黑色素巨噬细胞中心结构已经扩大区域，约比压塘3月龄的大一倍，脾脏主要由淋巴组织组成，分白髓、红髓2 个主要部分。红髓和白髓混合排列，两者无明显界限。白髓主要由较为密集的淋巴细胞组成；红髓由血细胞含量较多的脾索及大小形状不规则的脾窦组成(见图版Ⅰ-8)。

图1 各时期IgM与MHCⅠ在不同组织中的相对表达量

压塘3月龄草鱼免疫7 d后IgM(a)和MHCⅠ(b)在各组织中的表达量；压塘3月龄草鱼免疫14 d后IgM(c)和MHCⅠ(d)在各组织中的表达量；普通3月龄草鱼免疫7 d后IgM(e)和MHCⅠ(f)在各组织中的表达量；普通3月龄草鱼免疫14 d后IgM(g)和MHCⅠ(h)在各组织中的表达量(“*”表示差异显著，“**”表示差异极显著)

图2 不同时期各组织中IgM与MHCⅠ的相对表达量

i.不同时期各组织IgM相对表达量;j.不同时期各组织MHCⅠ相对表达量(Ⅰ7代表压塘3月龄草鱼免疫7 d后，Ⅰ14代表压塘3月龄草鱼免疫14 d后，Ⅲ7代表普通3月龄草鱼免疫7 d后，Ⅲ14代表普通3月龄草鱼免疫14 d后)

2.2 草鱼IgM、MHCⅠ 基因的相对表达量

免疫后IgM与MHCⅠ的相对表达量峰值均出现在普通3月龄草鱼免疫14 d后的中肾中(IgM为74.51倍(P<0.01)，MHCⅠ为56.02倍(P<0.01))。压塘3月龄草鱼在免疫7 d后，注射组的IgM和MHCⅠ在头肾、中肾、肠道和脾脏中的表达量均高于对照组。免疫14 d后，注射组IgM的相对表达量在中肾中显著高于对照组(1.48倍，P<0.05)，在头肾、肠道和脾脏中的相对表达量均低于对照组，但P值大于0.05不具统计学意义；注射组MHCⅠ在头肾、中肾、肠道和脾脏中的相对表达量均高于对照组。普通3月龄草鱼在免疫7 d后，注射组的IgM在头肾、中肾、肠道和脾脏中的相对表达量均高于对照组;注射组MHCⅠ的相对表达量在头肾、中肾和脾脏中均高于对照组，在肠道中的相对表达量低于对照组。免疫14 d后，注射组IgM的相对表达量在头肾、中肾、肠道和脾脏中均高于对照组，注射组MHCⅠ在头肾、中肾和脾脏中的相对表达量均高于对照组，在肠道中的相对表达量低于对照组(图1、图2)。

3 讨论

本研究对压塘3月龄草鱼和普通3月龄草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏进行了组织学观察，结果显示压塘3月龄草鱼头肾中仍有肾小管结构，处于混合型肾脏及分泌组织阶段；普通3月龄草鱼头肾中有大量淋巴细胞分布，未见肾小管，此结果与雷雪彬等[8]的发现一致。岳兴建等[9]在南方鲇上发现3月龄时，部分肾单位出现和成体相同的细胞形态。贝氏高原鳅中肾基本发育成熟是在出膜后80～135 d[10]。该实验观察到的压塘3月龄草鱼中肾单位多处于亚成熟状态；普通3月龄草鱼中肾已开始出现与成体相同的细胞形态。肠道是鱼类主要的消化器官和内分泌器官，同时也是最大的黏膜组织。压塘3月龄草鱼肠道中可观察到大量粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞；普通3月龄草鱼肠道粘膜组织中观察到的免疫相关细胞数量进一步增加，有研究[11-13]表明，黏膜组织中的粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞能接受外界抗原的刺激，引起局部免疫反应，在机体的免疫中起着重要的作用，这些可以有效诱发参与免疫应答的淋巴细胞主要在中后肠分布[14]。压塘3月龄草鱼脾脏没有分化为明显的红髓和白髓，有大量淋巴细胞和粒细胞分散在红细胞之间，具有一定免疫功能；普通3月龄草鱼脾脏中黑色素巨噬细胞中心结构团面积较大，有界限不明的红髓和白髓混合排列，此时脾脏具成熟的组织结构。组织学结果分析显示：压塘3月龄草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏发育迟缓，处于未成熟状态；普通3月龄草鱼的头肾、中肾、肠道和脾脏功能已趋于成熟。

IgM 是B淋巴细胞最早产生的免疫球蛋白，也是B 淋巴细胞分化过程中的主要表面标志[15]同时也是体液免疫最重要的指标之一，它可以中和血液循环中的病原[16]，或捕获脾边缘区的病原体，并增强抗原的免疫原性，以及对B 细胞进行增强活化[17]。目前，已有多种疫苗被证明能够显著性提高鱼体的IgM ，并使鱼体产生保护性免疫反应[7]。主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)能够识别、清除外来和内在抗原，在免疫学上具有极为重要的意义[18]。鱼类MHC主要包括MHCⅠ类和MHCⅡ类基因，其中MHCⅠ类分子主要参与内源性抗原的递呈[19]。本实验对这两个时期的草鱼进行草鱼出血病活疫苗(GCHV-892株) 腹腔注射，通过实时荧光定量PCR检测了IgM与MHCⅠ在免疫7 d与14 d后的头肾、中肾、肠道和脾脏中的相对表达量。IgM与MHCⅠ的相对表达量峰值出现在普通3月龄草鱼免疫14 d后的中肾中。普通3月龄草鱼免疫后头肾、中肾和脾脏中IgM的相对表达量均明显高于压塘3月龄草鱼，但在肠道中的表达量差异不明显，推测可能与本实验采用的注射免疫方式有关。Strand等[20]认为，肠道后半部分的上皮细胞可以通过内吞方式摄取并转移大分子抗原，转送到肠道固有层的巨嗜细胞和血液循环系统中。故口服免疫方式可能对肠道中IgM作用更明显，但具体影响机制还有待进一步探讨。压塘3月龄草鱼免疫后的两周时间内，MHCⅠ除在头肾中的相对表达量增幅变大，中肾、肠道和脾脏中的MHCⅠ相对表达量的增幅都有所下降。而普通3月龄草鱼在免疫后的两周时间内，各组织中的MHCⅠ相对表达量的增幅都有升高。故接种疫苗后，正常养殖的普通鱼能够比高密低投的压塘鱼更好地引起相关因子有效的免疫应答。宋晓青等[21]在针对牙鲆的研究中发现，草鱼和牙鲆在免疫后其脾脏和头肾中MHCⅠ都上调表达。奕志娟等[22]发现不同剂量的疫苗对脾脏中MHCⅠmRNA表达的影响均为先上调后下降的趋势，与本实验结果相似。其可能的应答机制为免疫细胞广泛存在的模式识别受体信号通路逐级传递抗原信息，迅速引起相关因子的转录[21]，说明疫苗免疫增强了机体呈递抗原的能力。

叶华等[23]根据齐口裂腹鱼较强细胞免疫出现的时间段，建议在齐口裂腹鱼养殖过程中，在由嗜水气单胞菌引起的疾病流行爆发季节到来之前的7～14 d，进行灭活菌苗注射以增强免疫力。苏友禄等[24]认为在免疫系统发育完善前注射疫苗会引起对此种抗原的耐受，因而其建议针对军曹鱼系统免疫的疫苗接种时间不应在24 dph以前，又或许在44 dph后接种疫苗效果更好。本实验在组织结构和免疫相关基因转录的数据都支持草鱼在正常发育3月龄时期免疫效果更好，而压塘3月龄草鱼由于各免疫器官发育尚未成熟，免疫效果不佳。综上所述，本研究观察了压塘3月龄草鱼和普通3月龄草鱼部分免疫器官组织的显微结构，并观察了草鱼出血病减毒活疫苗免疫注射后，草鱼主要免疫相关基因IgM与MHCⅠ的表达水平，发现在草鱼免疫组织结构发育完善的正常养殖3月龄时期进行疫苗注射免疫效果更好，而压塘3月龄草鱼由于养殖密度过大，投喂饲料不足等问题生长发育迟缓，免疫效果不佳。本研究结果为生产实践提供了科学可靠的基础资料，对草鱼出血病的免疫防治具有重要的实践指导意义。

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(责任编辑：张红林)

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图版Ⅰ 草鱼不同时期各组织的显微观察

1.压塘3月龄草鱼头肾，标尺:200 μm。2.普通3月龄草鱼头肾，标尺:50 μm。3.压塘3月龄草鱼中肾，标尺:200 μm。4.普通3月龄草鱼中肾,标尺:200 μm。5.压塘3月龄草鱼肠道，标尺:50 μm。6.普通3月龄草鱼肠道，标尺:50 μm。7.压塘3月龄草鱼脾脏，标尺:200 μm。8.普通3月龄草鱼脾脏，标尺:200 μm。

C.PD 肾小管；P 近端小管；DS 远端小管；MU 中肾单位；MC 肌层；MF 黏膜皱襞。)

The histology of immune organs of 3-month-old grass carp and transcriptional differences of immune genes after immunization

ZHANG Peng-ying1,2,CHANG Ou-qin1,SHI Cun-bin1,WU Shu-qin1

(1.KeyLabofAquaticAnimalImmuneTechnologyofGuangdongProvince,KeyLabofFisheryDrugDevelopmentofMinistryofAgriculture/PearlRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Guangzhou510380,China;2.CollegeofFisheryandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

In order to study the consistency between the degree of maturation and the body sizes of the grass carpCtenopharyngodonidellusin different breeding conditions,the experiment observed the microstructure of head kidney,kidney,intestine and spleen in high-density and low-feeding 3-month-old grass carp and common 3-month-old grass carp,and intraperitoneal injection of vaccine treatment was conducted in the two groups of grass carp.Head kidneys,kidneys,intestines and spleens were sampled on days 7 and 14 days after injection,and the expression levels of IgM and MHCⅠmRNAs in these organs were detected through the real-time fluorescence quantitative PCR(RT-PCR).The results showed that the development of different organs was slow in high-density,low-feeding 3-month-old grass carp,and the head kidneys,kidneys,intestines and spleens of common 3-month-old grass carp almost attained maturity.After immunization,the expression levels of IgM and MHCⅠmRNAs in these organs of high-density,low-feeding 3-month-old grass carp were significantly increased.The highest expression of IgM and MHCⅠ appeared in the kidney of common 3-month-old grass carp immunized 14 days (IgM for 74.51 times,MHC class Ⅰ for 56.02 times).Results showed that grass carp hemorrhage live vaccine can enhance the expression of IgM and MHCⅠ in head kidney,kidney,intestine and spleen of grass carp,and the age of 3 months period were the best immunization time.

grass carp;histology of immune organs;vaccine immunization;IgM;MHCⅠ

2016-04-13；

2016-05-23

现代农业产业技术体系建设专项资金“大宗淡水鱼类产业技术体系”(CARS-46)；“十二五”国家科技支撑计划：淡水养殖鱼类病害免疫防控关键技术研究与产品开发(2012BAD25B00)

张鹏英(1989- )，女，硕士研究生，专业方向为水产动物疾病防治。E-mail:504937622@qq.com

吴淑勤。E-mail:wushuqin001@21cn.com；常藕琴，E-mail:changouqin@163.com

S942.5

A

1000-6907-(2016)06-0064-08