黑尾近红鲌精子低温保存方法研究与应用

王贵英，张 涵，李 清，祝东梅， 陈 见， 李 佩 ，孙艳红

(1．武汉市农业科学技术研究院水产科学研究所，武汉 430207；2．武汉先锋水产科技有限公司，武汉 430207；3．湖北省潜江市水产技术推广中心，湖北潜江 433199)



黑尾近红鲌精子低温保存方法研究与应用

王贵英1,2，张 涵2,3，李 清1,2，祝东梅1,2， 陈 见1,2， 李 佩1,2，孙艳红1,2

(1．武汉市农业科学技术研究院水产科学研究所，武汉 430207；2．武汉先锋水产科技有限公司，武汉 430207；3．湖北省潜江市水产技术推广中心，湖北潜江 433199)

在4 ℃条件下，以精子活力为指标，研究了不同浓度的Na+、K+、Ca2+、Mg2+、葡萄糖、氨基酸等组成的5种(A、B、C、D、E)精子保存液及其适量添加青霉素对黑尾近红鲌(Ancherythroculternigrocauda)精子活力的影响。结果显示：1)温度为4 ℃时，精子活力达80%的保存液A、B、C、D、E的保存时间分别为48、24、60、48、48 h，保存液C的保存时间明显高于其它各组；2)在各保存液中分别添加浓度为2.0×104IU/mL的青霉素，精子活力达80%的保存液A、B、C、D、E的保存时间分别为60、36、156、48、144 h，保存时间延长了12 ～96 h，保存液C和E的延长时间最长，均为96 h；3)人工授精试验证明，经保存的黑尾近红鲌精子能正常用于人工繁殖，受精率达(90.6±0.8)%～(91.8±0.9)%，与对照组精子受精率(92.4±0.8)%无显著差异。添加青霉素，保存液C的保存效果最好，其次是保存液E。

黑尾近红鲌(Ancherythroculternigrocauda)；精子；保存液；青霉素；保存效果

CHEN Jian1,2,LI Pei1,2,SUN Yan-hong1,2

鱼类精子保存技术包括常温、低温和超低温保存技术。低温(4 ℃)保存是精子短期保存的常见方法，操作简便，能有效提高精液利用率，扩大苗种生产，尤其在精液难以获得或获得量较少时，以及在杂交育种中具有较大意义[1-3]。精子保存液作为精子体外保存过程中赖以生存的外环境，其离子成分、渗透压以及pH值等直接影响精子体外保存效果。鱼类精子低温保存在南方鲇(Silurusmeridionalis)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)、胭脂鱼(Myxocyprinusasiaticus)等鱼类中已有研究，并在实际生产中推广应用[4-6]。

黑尾近红鲌(Ancherythroculternigrocauda)俗称高肩、黑尾鲌等，隶属鲤科鲌亚科近红鲌属，是长江上游特有经济鱼类，也是我国渔业主导品种[7]，其肉质细嫩，味道鲜美，深受消费者喜爱[8]。随着生存环境的变化，自然资源日趋减少，捕获的个体逐渐小型化，急需加强对其人工繁殖和养殖方面的研究[9]。相关学者先后研究了个体繁殖力[10]、年龄与生长[11-13]、性状比例及体长与体重的关系[14]、耗氧率和窒息点[15]、消化酶活性[16]等生物学与生理特性，初步报道了人工繁殖技术[17-18]及幼鱼的营养需求[19-20]等。目前，关于黑尾近红鲌精子保存研究尚未见报道。本研究研究其精子在低温条件下不同保存液中的活力，以期探索精子保持最大活力的环境条件与保存时间，为精子保存液配制与保存提供科学依据，为黑尾近红鲌规模化人工繁殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验鱼来源

黑尾近红鲌来自武汉先锋水产科技有限公司养殖基地，体重450～530 g，性成熟良好，无病无伤。

1.2 精子保存液配制

根据鱼类精子生理要求，参照有关资料[1,4-6]配制A～E 5种精子保存液。

(1)精子保存液A配方：分别取Hanks精子保存液配方甲液、乙液各5 mL，混合后加蒸馏水定容至100 mL，即配制成精子保存液A。Hanks精子保存液配方见表1。

表1 Hanks 精子保存液配方

(2)精子保存液B配方(渔用任氏液)：NaCl 0.78 g，KCl 0.02 g，CaCl20.021 g，NaHCO30.002 1 g ，蒸馏水100 mL。

(3)精子保存液C配方：葡萄糖2.90 g，KCl 0.05 g，CaCl20.02 g，NaHCO30.21 g，蒸馏水100 mL。

(4)精子保存液D配方：NaCl 0.743 g，KCl 0.278 g，CaCl20.029 g，MgCl2·6H2O 0.030 g，NaHCO30.042 g，蒸馏水100 mL。

(5)精子保存液E配方：NaCl 0.690 3 g，KCl 0.094 6 g，CaCl20.03 g，MgCl2·6H2O 0.014 2 g，Na2HPO40.054 g，NaHCO30.399 9 g，酪氨酸0.099 6 g，甘氨酸0.041 2 g，牛血清白蛋白0.411 g，蒸馏水100 mL。

以上精子保存液均用可密封棕色玻璃瓶低温保存备用。

1.3 试验设计

以A～E精子保存液和A～E精子保存液分别添加2.0×104IU/mL青霉素，在低温4 ℃条件下保存黑尾近红鲌精子，比较各配方的精子保存效果。前12 h每隔2 h观察精子活力1次，以后每隔12 h观察精子活力1次。观察保存在精子保存液中黑尾近红鲌精子活力随时间而变化的规律，确定最佳精子保存液配方与保存时间。

1.4 精子采集保存

选用10 mL可密封避光离心管，经灭菌处理后作精子保存容器用，共30个。采精前擦干鱼体并排除尿液和粪便，轻轻挤压腹部，当有乳白色精液流出时，立即用吸管收集注入精子保存液中，精液与保存液比例为1∶5，采集结束后4 ℃低温保存。每种精子保存液分3组保存观察。

1.5 精子活力观察

以精子被激活后的活力(快速运动精子占总精子数的百分比)为指标对保存效果进行评价。观察时先将保存有精子的精子保存液取出摇匀，然后用移液枪吸出一小滴置于载玻片上，在显微镜16×10倍数下观察精子，观察到精子后立即用半滴蒸馏水激活精子，观察其运动情况并记录。精子活力区分与记录方法按文献[4]进行。

1.6 受精效果观察

采用保存效果最优的保存液保存黑尾近红鲌精子，通过人工授精验证经短期低温保存的精子受精效果。

在繁殖季节挑选性成熟良好、体质健壮的黑尾近红鲌亲鱼，用PG、HCG和LRH-A2进行催产，发情时起捕亲鱼，轻压雌鱼腹部获取卵子，随机分成9组，每组550～600粒，置入干燥、洁净的培养皿中；分别及时加入1 mL黑尾近红鲌鲜精和最优保存液保存的精子(取100%、80%以上快速运动达最长时间点的精子)混匀，迅速加入10 mL 0.7%的生理盐水充分混匀并防止卵粒堆积，立即加入100 mL蒸馏水后静置平放，待受精卵完全粘附培养皿后置换蒸馏水5次，排出精卵带入的其它物质影响孵化环境；10 h后受精卵处于囊胚中期时观察并统计受精卵，计算受精率。

2 结果

2.1 5种(A～E)精子保存液的保存效果比较

低温4 ℃条件下，A、B、C、D、E 5种精子保存液对黑尾近红鲌精子的保存效果表现出明显差异，具体结果见表2。

表2 不同精子保存液对黑尾近红鲌精子的保存效果

注：*表示添加2.0×104IU/mL青霉素的精子保存液。“+++”表示100%精子快速运动，“++”表示80%以上的精子快速运动，“+”表示50%精子快速运动，“+-”表示10%～30%精子快速运动，“-”表示全部死亡或少量在原地振动。

用精子保存液A、B、C、D、E保存黑尾近红鲌精子，100%的精子处于快速运动状态时，保存时间分别为24、10、36、24、24 h；80%的精子处于快速运动状态时，保存时间分别为48、24、60、48、48 h。此后的精子活力明显下降，其中保存液A、D组下降更明显，未能观察出快速运动精子为50%的保存时间；保存液B、C、E分别保存至36、72、60 h时，快速运动精子为50%。用精子保存液A、B、C、D、E分别保存至60、48、84、60、72 h时，仅10%～30%的精子处于快速运动状态；精子基本死亡或少量原地振动时，保存时间分别为72、60、96、72、84 h。

A、B、C、D、E 5种精子保存液保存黑尾近红鲌精子，以精子保存液C的保存效果最好，精子活力为80%的保存时间(60 h)比A、D、E等保存液组延长了12 h，比保存液B组延长了36 h；其次为保存液E，精子活力为80%的保存时间与保存液A和D组别一致、比保存液B组延长24 h，但精子活力为50%的保存时间比保存液A、D组别长；保存液B的保存效果最差。

2.2 适量添加青霉素的5种(A～E)精子保存液保存效果比较

低温4℃条件下，在A、B、C、D、E 5种精子保存液中分别添加2.0×104IU/mL青霉素，黑尾近红鲌精子保存效果表现出明显差异，具体结果见表2。

精子保存液A、B、C、D、E分别添加2.0×104IU/mL青霉素保存黑尾近红鲌精子，100%的精子处于快速运动状态时，保存时间分别为36、10、84、24、48 h；80%的精子处于快速运动状态时，保存时间分别为60、36、156、48、144 h。此后的精子活力明显下降，其中保存液A、D组下降更明显，与未添加青霉素组一样未能观察出快速运动精子为50%的保存时间；保存液B、C、E分别保存至48、168、156 h时，快速运动精子为50%。用精子保存液A、B、C、D、E分别保存至72、60、180、60、168 h时，仅10%～30%的精子处于快速运动状态；精子基本死亡或少量原地振动时，保存时间分别为84、72、192、72、180 h。

在各保存液中分别添加浓度为2.0×104IU/mL的青霉素，精子活力达80%的A、B、C、D、E保存液的保存时间延长了12 ～96 h。保存液C和E的延长时间最长，均为96 h；保存液A、B的延长时间均为12 h，保存液D与未添加组基本一致。

结果表明，在保存液中添加2.0×104IU/mL的青霉素，保存液C的保存效果最好，精子活力达80%的保存时间为156 h；其次是保存液E，精子活力达80%的保存时间为144 h。

2.3 保存液保存的精子人工授精结果

采用添加2.0×104IU/mL青霉素的保存液C保存黑尾近红鲌精子，分别取保存至84 h(精子活力100%)和156 h(精子活力80%)的精子与刚排出的成熟卵子进行人工授精，并与新鲜精液精子的受精效果进行比较。由表3可见，添加2.0×104IU/mL青霉素的保存液C保存精子至84 h和156 h的黑尾近红鲌受精率分别为(91.8±0.9)%、(90.6±0.8)%，而刚排出的黑尾近红鲌新鲜精液精子受精率为(92.4±0.8)%；经显著性检验分析，三者受精率无显著性差异(P>0.05)。

表3 精子保存液保存的黑尾近红鲌精子人工授精结果

※ 同列标注相同字母a表示差异不显著(P>0.05)。

由此验证，添加青霉素(2.0×104IU/mL)的保存液C为最优的黑尾近红鲌精子保存液，经低温短期保存(4 ℃，156 h)的精子用于人工繁殖的效果与新鲜精液的效果相当。

3 讨论

鱼类精浆成分主要包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、葡萄糖、氨基酸等，这些成分均为精子存活的重要基础[1,21-24]。在精子保存液配制方面，目前尚无统一标准，一般原则为：保存液与保存的精液等渗或稍高渗，以抑制精子运动；具有一定的缓冲能力；含有一定的营养物质，以供精子在低温下微弱的代谢需要[25]。本试验中的配方是基于相关学者精子保存环境研究以及模拟保存配方，旨在实践操作中为精子提供与体内相似的环境，从而达到长时间保存效果。笔者根据上述原则配制的A、B、C、D、E 5种精子保存液的保存效果差异较大，保存液C对黑尾近红鲌精子的保存效果最好，80%的精子呈快速运动状态的时间达60 h；其次是保存液E，80%的精子呈快速运动状态的时间虽与保存液A、D组一致，继续保存时，50%的精子呈快速运动状态的时间比A、D组长；保存液B的保存效果最差，80%的精子呈快速运动状态的时间仅24 h。

有研究报道，Ca2+、Mg2+对鲤(Cyprinuscarpio)和团头鲂(Megalobramaamblycephala)等精子有抑制作用[26]。本实验中的保存液A、D、E组均含有Ca2+、Mg2+，未表现出明显提高精子保存效果的作用；而保存液C组无Mg2+，但葡萄糖含量较高(0.029 g/ mL)，其保存时间最长。这可能与不同物种的精子特性、C组中的葡萄糖为精子提供较好的营养有关。

严安生等[27]研究表明，单糖对精子的活力有影响，体外受精鱼类的精子具有利用细胞外源性小分子单糖来补偿自身消耗的能力。从保存液配方来看，A组中影响渗透压和精子活力的Na+、K+、Ca2+、Mg2+等离子明显高于C组，C组中的葡萄糖(0.029 g/mL)显著高于A组(0.001g/mL)，另外3组保存液中均不含葡萄糖；这表明在上述一定的离子浓度范围内，保存液中适量添加葡萄糖可延长黑尾近红鲌精子的保存时间。

沈建忠等[4]对南方鲇精子保存液研究结果表明，牛血清蛋白和氨基酸作营养物质对南方鲇精子活力的保存有很好的效果，比仅添加葡萄糖作营养物质的效果强。本实验中，只添加葡萄糖作营养物质的保存液C的保存效果略优于保存液E。这与沈建忠等结果相异，添加牛血清蛋白和氨基酸的具体原因有待进一步研究。

在精子采集和保存过程中难免会带入细菌，从而导致保存液污染或精子感染死亡。以往的研究报道中通常青霉素的使用量为0.5×104～1.0×104IU/mL[28-29]；本研究添加2.0×104IU/mL青霉素，除保存液D外，其它各添加组均延长了精子保存时间，与赵钦等[5]对黄颡鱼的研究结果一致；保存液C组156 h内精子活力超过80%，人工繁殖时与新鲜精子受精效果相当，经短期低温保存的精子完全可用于实际生产中。添加同样浓度青霉素的保存液D组未能延长精子保存时间，这是否与该配方添加此浓度青霉素未能改善精子保存条件或精子采集过程中污染较严重有关有待进一步研究。

综上所述，低温4 ℃条件下，在保存液中添加2.0×104IU/mL青霉素，保存液C的保存时间最长，其次是保存液E，保存液C、E使精子活力达80%的保存时间分别为156、144 h，能满足黑尾近红鲌人工繁殖或育种需求；且保存液C的配制成本低廉，方法简单，保存条件易满足，操作方便，适合在生产上推广应用。

[1]丁淑荃,万 全,李 飞,等.蛇鮈精子保存液的筛选及其效果研究[J].生物学杂志，2012， 29(6)：62-64.

[2]杨 广，张 丽，肖立新.兴国红鲤精子在不同保存条件下的活力研究[J].淡水渔业，2003，33(6)：34-35.

[3]Fujinami Y,Takeuchi H,Tsuzaki T,et al.Sperm motility and short term preservation of testicular spermatozoa obtained from captured and dead red tilefishBranchiostegusjaponicus[J].Nippon Suisan Gakkaishi,2003,69(2):162-169.

[4]沈建忠，江 庆.南方鲇精子保存方法的初步研究[J].水利渔业，2002,22(5)：13-15.

[5]赵 钦，陈校辉，潘建林.黄颡鱼精子低温保存方法的初步研究及应用[J].水产科学，2008，27(12)：615-618.

[6]万 全，李 飞.胭脂鱼精子低温保存及其在人工授精中的应用[J].安徽农业科学，2009，37(3)：1122-1123.

[7]中华人民共和国农业部渔业局，全国水产技术推广总站.渔业主导品种和主推技术[M].北京：中国农业出版社，2013：159-161.

[8]谭德清，王剑伟，但胜国.黑尾近红鲌含肉率及肌肉营养成分分析[J].水生生物学报，2004，28(3)：240-246.

[9]刘军.长江上游特有鱼类受威胁及优先保护顺序的定量分析[J].中国环境科学，2004，24(4)：395-399.

[10]薛正楷，何学福.黑尾近红鲌个体繁殖力的研究[J].西南师范大学学报(自然科学版)，2001，26(1)：90-94.

[11]薛正楷，何学福.黑尾近红鲌的年龄和生长研究[J].西南师范大学学报(自然科学版)，2001，26(6)：712-717.

[12]王贵英，张训蒲，李 清.黑尾近红鲌在人工养殖条件下的生长[J].福建水产，2009，(1)：77-83.

[13]曹义虎，马保新，邓勇辉，等.池塘养殖条件下黑尾近红鲌0+～2龄的可量性状研究[J].安徽农业科学，2011，39(33)：20498-20500.[14]薛正楷，何学福.黑尾近红鮊的比例性状、体长质量关系和丰满度[J].西南师范大学学报(自然科学版)，2002，27(5)：811-815.

[15]李 清.黑尾近红鲌鱼种耗氧率和窒息点的初步研究[D].武汉：华中农业大学，2008.

[16]白晓慧，王贵英，熊传喜.不同年龄黑尾近红鲌消化酶活性比较[J].淡水渔业，2007，37(3)：30-34.

[17]谭德清，王剑伟，严太明，等.黑尾近红鲌人工繁殖研究[J].长江流域资源与环境，2004，(2)：193-196.

[18]殷海成，吕海英.黑尾近红鲌人工繁殖及胚胎发育的研究[J].大连海洋大学学报，2010，25(3)：265-269.

[19]丁立云，曹义虎，周秋白，等.黑尾近红鲌幼鱼对蛋白质营养需求的初步研究[J].江苏农业科学，2012，40(10)：1002-1302.

[20]李伟东，黄 峰，王贵英，等.饲料脂肪水平对黑尾近红鲌生长性能及鱼体成分的影响[J].粮食与饲料工业，2014，(11)：56-60.

[21]鲁大椿，刘宪亭，方建萍，等.我国主要淡水养殖鱼类精浆的元素组成[J].淡水渔业，1992，22(2)：10-12.

[22]鲁大椿，游文章，方建萍，等.我国主要淡水养殖鱼类精浆的氨基酸成分[J].淡水渔业，1987，7(3)：14-16.

[23]Marian T,Kraszna I Z,Balka Y L,et al.Hypo-osmotic shock induces an osmolality-dependent permeabilization and structural changes in the membrane of carp sperm [J].J Histochem Cytochem,1993,41(2):291-297.

[24]陈东华，李艳东，贾林芝，等.保存液中Ca2+、Mg2+、K+对中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)精子体外保存存活率的影响[J].海洋与湖沼，2007，38(6)：585-589.

[25]陈松林，刘宪亭，鲁大椿，等.鲤、鲢、鳙精子低温短期保存研究[J].淡水渔业，1992，22(3)：3-7.

[26]严安生，李诗模，王其和.鲤鱼和团头鲂精子生理生态特性的研究Ⅱ.钙、镁对精子活力的影响[J].淡水渔业，1993，23(5)：5-7.

[27]严安生，宋贵文，闫拥军.鲤、团头鲂精子生理生态特性的研究Ⅲ.单糖和渗透压对精子活力的影响[J].淡水渔业,1995,25(2):3-5.

[28]邓岳松.鱼类精液的低温保存[J].水利渔业，1999，29(4)：7-8.

[29]鲁大椿，刘宪亭，章龙珍.鱼类精液冷冻保存技术操作规程[J].淡水渔业，1997，27(4)：13-15.

(责任编辑：陈细华)

Preservation of sperm from Ancherythroculter nigrocauda at low temperature and its application

WANG Gui-ying1,2,ZHANG Han2,3,LI Qing1,2,ZHU Dong-mei1,2,

( 1.FisheriesResearchInstitute，WuhanAcademyofAgriculturalScience&Technology,Wuhan430207,China;2.WuhanXianfengAquacultureTechnologyCo.Ltd.,Wuhan430207,China;3.QianjiangFisheriesTechnologyPromotionCenter,Qianjiang433199,Hubei,China)

Under the condition of low temperature (4oC),we studied the effects of 5 kinds of sperm preservation solutions (A,B,C,D,E) containing different concentration of Na+,K+,Ca2+,Mg2+,amino acid,glucose and adding moderate amount of penicillin on the sperm motility inAncherythroculternigrocauda,to explored the best preservation condition of the sperm vitality as indicators.The results showed that:1) Under the temperature of 4 ℃,the preservative solution of A,B,C,D and E could keep 80% of spermatozoa having fast motility within 48,24,60,48,48 h respectively,and the preservation time of C solution was obviously higher than that of other groups;2) With the addition of 2.0×104IU/mL penicillin,A,B,C,D and E could keep 80% of spermatozoa having fast motility within 60,36,156,48,144 h respectively,and the preservation time were prolonged for 12 h ～ 96 h.C and E solutions were extended to the longest time both with 96 h;3) The experiment of artificial insemination proved that the preserved sperm ofA.nigrocaudacould be normally used for artificial breeding,and the fertilization rate (90.6±0.8)%～(91.8±0.9)% had no significant difference (p>0.05) compared with control group fresh sperm (92.4±0.8%).The results indicated that among the preservation solutions with addition of 2.0×104IU/mL penicillin,the C solution had the best preservation effect,followed by E,which could be applied in the factory production.

Ancherythroculternigrocauda;sperm;preservation solution;penicillin;preservation effect

2016-01-13；

2016-05-27

国家科技计划项目(2015BAD25B01-5)；武汉市黄鹤英才计划项目(武人才办[2014]8号，序号19)；武汉市科技计划项目(20032003035、2013020705070350-15、2014020202010137)

王贵英(1965- )，女，硕士，高级工程师，主要从事鱼类育种与健康养殖研究。E-mail：whxfsc@163.com

李 清。E-mail：xfsckj@163.com

S917.0

A

1000-6907-(2016)06-0003-05