黑曲霉孢子粉粗提物对两种植物病菌的抑制作用

刘芳，肖洋，李祝*，郭博恺，胡绵绵，冉江，郭崇韬

（1.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025；2.贵州省产品质量监督检验院，贵州贵阳550004；3.贵州大学药学院，贵州贵阳550025）

黑曲霉孢子粉粗提物对两种植物病菌的抑制作用

刘芳1，肖洋2，李祝1*，郭博恺3，胡绵绵1，冉江1，郭崇韬1

（1.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025；2.贵州省产品质量监督检验院，贵州贵阳550004；3.贵州大学药学院，贵州贵阳550025）

黑曲霉是集安全和具有许多活性强大酶系等诸多优点于一身的优良工业发酵用菌种。研究分离得到一株黑曲霉（Aspergillus niger）xj，为充分开发利用这一真菌资源，利用50 g含有1×109CFU/g、5×109CFU/g、15×109CFU/g黑曲霉孢子的干燥孢子体粉末提取出三种不同的浸膏，并在筛选最佳接种量和最佳培养时长的基础上对这3种浸膏进行抑菌试验，发现这3种浸膏对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）及根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）这两种常见植物病菌均体现了良好的抑制效果，且抑制率均＞92.02%。

黑曲霉；粗提物；植物病菌；抑菌作用

植物病菌每年均使我国在农业方面产生了巨大的经济损失，青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是两种常见的植物病菌。青枯雷尔氏菌对许多农产品都有病害作用，可侵染44个科的数百种植物[1]，包括许多重要的经济作物（如马铃薯、花生等）[2]，由青枯雷尔氏菌引起的烟草青枯病已迅速扩展蔓延至主要产烟国家，成为制约烟草生产的主要病害[3]，同时也是威胁世界烟草生产的一大毁灭性病害[4]。该病对我国仅七个省烟草业造成的经济损失每年就高达两千万元以上[5]，此外，根癌农杆菌也是一种世界性植物病菌，给农业生产带来了巨大的经济损失[6]，在欧洲[7]、北美[8]及亚洲[9]的一些国家普遍发生，可侵染93科331属643种双子叶植物和少数裸子植物[10]。虽然现在有许多科学家都在研究对抗这些植物病菌的方法，如2005年薛庆云等[11]研究了青枯病的防治，而至今仍没有有效的抑制方法；2013年由汪可宁等[12]结合了我国50年以来与植物病菌的对抗经验提出，要想对植物病菌进行良好的防治就必须从基因改良方面或者病原菌抑制方面入手；2016年马超等[13]也提出消灭有害病菌，合理利用现有资源，建设资源节约环境友好的新型社会是当今时代的主流，现在对植物病菌的生物防治研究中，已有利用拮抗抑制的报道，而黑曲霉作为一个安全的优势发酵菌种，运用在抗菌药物研究与开发中的报道甚少[14]，此次实验在前期工作的基础上利用黑曲霉孢子粉粗提物对青枯雷尔氏菌、根癌农杆菌这两种常见植物病菌进行抑菌试验。最终达到分离出对根癌农杆菌等植物病菌有高抑制活性的组分的目的，这一目标的实现将对我国农业生产产生重要影响。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株来源

黑曲霉（Aspergillus niger）xj：贵州大学真菌资源研究所分离，保藏于中国典型培养物保藏中心，CCTCC NO：M206021。

青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）Q11-2：分离自贵州省毕节地区大方县烟草青枯病株，保存于贵州大学生命科学学院微生物实验室，以下简称Q11-2。

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）T-37：购于中国农业科学院土壤肥料研究所，保存于贵州大学真菌资源研究所，以下简称T-37。

1.1.2药品与试剂

注射用青霉素钾（80万）：四川金瑞克动物药业有限公司；注射用氨苄西林钠：中诺药业（石家庄）有限公司；二甲基亚砜分析纯：广东光华科技股份有限公司。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，121℃灭菌20 min。

1.2仪器与设备

SW-CJ-IFD超净工作台：苏州市金净进化设备科技有限公司；MLS-3750型独立式高温高压灭菌锅：北京诺汇诚科技有限公司；SKY-2112B双层特大容量恒温培养摇床：上海达平仪器有限公司；TopPette移液枪：大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；759紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司。

1.3实验方法

1.3.1黑曲霉孢子粉粗提物的制备

将50 g含有1×109CFU/g、5×109CFU/g、15×109CFU/g黑曲霉孢子的干燥孢子体粉末，用200 mL丙酮、60℃回流3 h，滤出丙酮并重复以上步骤2次，对三次滤液一起旋蒸，分别得到0.452 g、0.452 g、0.756 g浸膏初提物，设定编号为“1”、“2”、“3”。

1.3.2菌株Q11-2、T-37最大吸收波长的确定

将供试菌株先接种在牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，再在牛肉膏蛋白胨液体培养基中分别接入一环Q11-2、T-37，在37℃、120 r/min的条件摇床培养12 h后取出，用759紫外可见分光光度计在波长300～650 nm范围内进行全波长扫描，确定其最大吸收波长。

由表3可知，近年来，随着“一带一路”倡议的实施，中约经贸合作呈现良好发展态势。中国和约旦的贸易总额，由2007年的11.95亿美元增加到2016年的31.65亿美元，年均增长率为11.4%。其中，中国对约旦的进口额从2007年的0.821亿美元增加到2016年的2.112亿美元，年均增长率为11.1%，中国对约旦出口额由2007年11.13亿美元增加到2016年的29.54亿美元，年均增长率为11.5%。由此，在进出口年均增长率基本相同的情况下，随着贸易额的逐年增加，中国对约旦贸易顺差也在逐年扩大。

1.3.3测定药筛时的最佳接种量和最佳培养时间

菌悬液制备：供试菌株先接种在牛肉膏蛋白胨培养基斜面上，再在牛肉膏蛋白胨液体培养基中分别接入一环Q11-2、T-37并在37℃、120 r/min的条件进行摇床培养，制成Q11-2、T-37的菌悬液。

Q11-2最佳接种量和最佳培养时长的测定：在100 mL的液体培养基中按2.5%、5%、10%、15%、20%、25%的接种量接入Q11-2，并在37℃、120r/min的条件下进行摇床培养，分别在0h、1.5h、3h、4.5h、6h、7.5h、9h、10.5h、12h、13.5h、15 h、16.5 h、18 h取出3 mL在最适波长条件下测其OD值，每个处理三次重复。绘制出Q11-2的生长曲线，根据其生长曲线从而确定最佳接种量和最佳培养时长的范围。

T-37最佳接种量和最佳培养时长的测定：在100 mL的液体培养基中按10%、15%、20%、25%、30%的接种量接入T-37，并在37℃、120 r/min的条件下进行摇床培养，且分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h、24 h、26 h、28 h、30 h、32 h取出3 mL在最适波长条件下测其OD值。绘制出T-37的生长曲线，根据其生长曲线从而确定最佳接种量和最佳培养时长的范围。

1.3.4黑曲霉孢子粉粗提物的抑菌试验

分别在6 mL的液体培养基中加入60 μL用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制的质量浓度为80 mg/mL的黑曲霉孢子粉粗提物（“1”、“2”、“3”）、等体积的DMSO及用无菌水配制的质量浓度为80 mg/mL的阳性对照药，在1.3.3确定的最适接种量的基础上接入相应的植物病原菌，并在37℃、120 r/min的条件下进行摇床培养，根据1.3.3确定的最佳培养时长培养一定时间后取出在最适波长条件下测定其OD值。进而算出其抑菌率。

2　结果与分析

2.1最大吸收波长的确定

将不同菌的菌悬液在不同波长条件下测其OD值，结果见图1。

图1　青枯雷尔氏菌Q11-2(A)、根癌农杆菌T-37(B)的紫外吸收光谱图Fig.1　Ultraviolet absorption spectra ofRalstonia solanacearum Q11-2(A)andAgrobacterium tumefaciens(B)

从图1可知，Q11-2最大吸收波长为420 nm，T-37的最大吸收波长为400 nm。

2.2最适接种量及最佳培养时长的测定

通过测定Q11-2、T-37在不同接种量下的生长曲线来进行最佳适接种量和最佳培养时间的测定，结果见图2。

图2　青枯雷尔氏菌Q11-2(A)、根癌农杆菌T-37(B)的生长曲线Fig.2　Growth curve ofRalstonia solanacearumQ11-2(A)and Agrobacterium tumefaciens(B)

由图2（A）可知，Q11-2在各接种量条件下的生长曲线趋势几乎完全相同，当培养到达9 h时，达到稳定生长期，当培养15 h时，开始进入衰亡期，所以确定Q11-2药筛时的最佳培养时间为9～15 h。不同接种量对其生长曲线的吸光度值均在最佳范围为0.1～0.8内[15]，故均可以用来进行抑菌实验，本次实验采用10%的接种量进行。由图2（B）可知，T-37的不同接种量对其生长曲线的测定没有显著影响，10%～30%的接种量均可用于实验，本次实验采用10%的接种量进行，培养达到16 h时开始进入稳定生长期，故T-37最佳培养时长为16 h。

2.3黑曲霉孢子粉粗提物对Q11-2、T-37的抑菌试验

黑曲霉孢子粉粗提物对Q11-2、T-37的抑菌试验结果见图3。

由图3可知，黑曲霉孢子粉粗提物“1”、“2”、“3”对Q11-2和T-37都有良好的抑制效果，其抑制率均＞92.02%，其抑菌率均高于阳性对照药的抑制效果，且从图中可以看出其抑菌率由“1”～“3”均呈递增趋势。由此可初步得出一定质量的黑曲霉孢子体粉末内所含的孢子数越多，其抑菌效果越佳。

图3　黑曲霉孢子粉粗提物对青枯雷尔氏菌Q11-2(A)、根癌农杆菌T-37(B)的抑菌结果Fig.3　Anti-bacteria results of crude extracts from spore powder of Aspergillus nigeronRalstonia solanacearumQ11-2(A)and Agrobacterium tumefaciens(B)

3　讨论

黑曲霉xj是从患有冠瘿病的葡萄树根际土壤中分离获得的，与植物病原菌有相似的生态环境，生长快，且分泌抑菌物质多[16]，本研究利用黑曲霉孢子粉提取出3种粗提物，编号为“1”、“2”、“3”，同时利用青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）Q11-2、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）T-37两种常见植物病菌作为指示菌，在利用不同接种量的生长曲线确定了药筛实验的最佳接种量和最佳培养时长后对黑曲霉孢子粉粗提物进行抑菌实验，试验结果表明黑曲霉孢子粉粗提物“1”、“2”、“3”对Q11-2及T-37均有良好的抑制效果，且抑制率均高达92.02%以上。通过此次研究，基本确定了黑曲霉孢子粉粗提物对Q11-2、T-37等常见植物病菌有良好的抑制作用，且其抑菌率随着孢子数目的增多而升高，但其具体的抑菌机制还需要在进一步的实验中进行研究和探索。

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Inhibition effect ofAspergillus nigerspores crude extracts on two botanic bacteria

LIU Fang1,XIAO Yang2,LI Zhu1*,GUO Bokai3,HU Mianmian1,RAN Jiang1,GUO Chongtao1
College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Guizhou Province Product Quality Supervision and Inspection Institute,Guiyang 550004,China;3.College of Pharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Aspergillus nigeris an excellent industrial strain for fermentation,for it is safe and gathers many powerful active enzyme system.In the research,a strain ofA.nigerxj was isolated.In order to fully explore and utilize the fungus resources,50 g dry spoophyte powder containing 1×109CFU/g,5×109CFU/g,15×109CFU/g ofA.nigerspores was used respectively to extract three different extracts.Under the optimal inoculum and culture time,bacteriostasis experiments on three extract were carried out.Results showed that the three extracts showed good inhibition effect on Ralstonia solanacearumandAgrobacterium tumefaciens,and the inhibition rate was all higher than 92.02%.

Aspergillus niger;crude extracts;botanic bacteria;bacteriostasis

Q939.95

0254-5071（2016）10-0103-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.023

2016-06-22

贵州省科技厅社发项目（黔科合SY字[2014]3053）；国家自然科学基金（31460486）；贵州省科技厅农业攻关项目（黔科合NY [2014]3033）；贵州大学SRT项目

刘芳（1994-），女，本科生，研究方向为植物病害防治。

李祝（1978-），女，教授，博士，研究方向为植物病害防治。