HPLC同时测定人参五味子颗粒中3种人参皂苷含量

吴军红吴文中

（1驻马店市食品药品检验所，河南 驻马店 463000；2深圳大学第一附属医院，广东 深圳518035）

HPLC同时测定人参五味子颗粒中3种人参皂苷含量

吴军红1吴文中2

（1驻马店市食品药品检验所，河南 驻马店 463000；2深圳大学第一附属医院，广东 深圳518035）

目的：建立高效液相色谱法同时测定人参五味子颗粒中人参皂苷Rg1，Re，Rb1含量的方法。方法：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；以乙腈-水为流动相，梯度洗脱；检测波长为203 nm；流速1.0 m L/min；柱温30℃。结果：人参皂苷Rg1进样量在0.160～3.200μg（r=0.999 7）、人参皂苷Re进样量在0.216～ 4.320μg（r=0.999 9）、人参皂苷Rb1进样量在0.274～5.480μg（r=0.999 3）范围内线性关系良好，平均回收率分别为98.63%（RSD=1.13%），98.26%（RSD=1.17%），98.74%（RSD=1.07%）。结论：本方法简单、准确，专属性强，重复性好，能同时测定人参五味子颗粒中3种人参皂苷含量。

人参五味子颗粒；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；人参皂苷Rb1；高效液相色谱法

人参五味子颗粒收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第四册[1]，系由生晒参、五味子两味传统中药组成的复方制剂，具有益气敛阴，安神镇静功效。用于病后体虚，神经衰弱。其中人参为贵细药材，具有大补元气，生津养血，安神益智等功效，原质量标准只有人参的薄层鉴别，近年来郭强[2]曾对五味子进行了标准提高，生晒参定量分析未见文献报道。为更好地控制产品质量，提高临床疗效，本文将人参皂苷Rg1，Re，Rb1作为测定指标，建立高效液相色谱法（HPLC）同时测定人参五味子颗粒中人参皂苷Rg1，Re，Rb1含量的方法，现报道如下。

1　仪器与试药

安捷伦1260型高效液相色谱仪 （G4212B二极管阵列检测器，G1329B标准自动进样器，G1316A标准柱温箱）；电子天平（BP211D，十万分之一）；人参皂苷 Rg1（供含量测定用，批号：110703-201027，含量以96.3%计）、人参皂苷Re（供含量测定用，批号：110754-200421）、人参皂苷Rb1（供含量测定用，批号：110704-200921，含量以92.6%计）、均购自中国食品药品检定研究院；人参五味子颗粒由广西邦琪药业集团有限公司提供（批号：141104，150402，150807）；阴性样品按处方工艺，由驻马店市中医院制剂室制备；甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件

Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱 （4.6 mm × 250 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（表 1）；检测波长：203 nm；流速：1.0 m L/m in；柱温：30℃。

表1　流动相梯度洗脱程序

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液制备精密称取人参皂苷Rg1对照品16.61 mg、人参皂苷Re对照品21.60 mg、人参皂苷Rb1对照品29.59 mg，置100 m L量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1 m L中含人参皂苷Rg10.160 mg、人参皂苷Re 0.216 mg、人参皂苷Rb10.274 mg）。

2.2.2供试品溶液制备[3]取本品1袋，研细，精密称取1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50m L，称定质量，超声处理（功率240 W，频率45 kHz）30分钟，放冷至室温，称定质量，用70%乙醇补足减失质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 m L，蒸干，残渣用水15 m L溶解，再用水饱和正丁醇萃取3次（25，25，20 m L），合并正丁醇液，用氨试液洗2次，每次20 m L，弃去氨试液，正丁醇液浓缩至干，残渣加甲醇溶解并定容至5 m L量瓶，即得。

2.2.3阴性样品溶液制备精密量取阴性样品1 g，按“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.3系统适用性试验

按照“2.1”色谱条件，吸取对照品溶液、批号为150807的供试品溶液、阴性样品溶液，自动进样10μL，记录色谱图，理论板数按人参皂苷Rg1峰计大于6 000，分离度大于1.5，阴性无干扰。见图1。

图1　混合对照品、样品、阴性样品HPLC图

2.4线性关系考察

精密吸取对照品混合溶液1.0，2.0，5.0，10.0，20.0μL，自动进样，以峰面积积分值对进样量（μg）进行回归处理，得人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Re、人参皂苷Rb1的标准曲线分别为：

Y=14.12+364.243 3X（r=0.999 7）；

Y=2.482+385.122 9X（r=0.999 9）；

Y=5.699+296.947 2X（r=0.999 3）。

结果表明，人参皂苷 Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷 Rb1进样量分别在 0.160～3.200，0.216～4.320，0.274～5.480μg线性关系良好。

2.5精密度试验

精密吸取上述对照品混合液10μL，连续进样6次，记录峰面积。结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的峰面积RSD分别为0.89%，0.76%，0.94%，表明本方法精密度良好。

2.6稳定性试验

精密吸取批号为150807的供试品溶液，分别于0，1，3，6，9，12，24 h进样10μL，依法测定。人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1峰面积RSD分别为0.91%，1.15%，1.09%，结果表明样品在24 h内性质稳定。

2.7重复性试验

取同一批号样品（150807）6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进行测定。人参皂苷Rg1、人参皂苷 Re、人参皂苷 Rb1的 RSD分别为1.26%，0.98%，1.38%，结果表明重现性良好。

2.8加样回收试验

取已知含量的批号为150807的样品1 g，共6份，分别置25 m L量瓶中，再精密加入对照品混合液 5 m L，按“2.2.2”项下方法制备，进样测定，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的加样回收率见表2。

2.9样品测定

取人参五味子颗粒样品3批各3份，以“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，按外标法计算含量，结果见表3。

表2　加样回收率测定结果

表3　样品测定结果

3　讨论

3.1色谱条件的选择

按照《中国药典》及相关文献[4-6]方法确定柱型、流速和检测波长及梯度洗脱系统，通过实验发现人参皂苷Re后面、人参皂苷Rb1前面有部分杂质峰，影响其分离效果，参考了相关文献报道[7]的梯度洗脱系统按照其流动相比例变化，可以实现人参皂苷Re峰、人参皂苷Rb1峰与杂质峰有效分离，且该梯度洗脱系统能够使各峰型稳定，峰型均较好，因此采用本梯度洗脱系统。

3.2样品处理方法

本试验供试品溶液制备方法较多[8]，根据该制剂处方工艺，2味药材均为浸膏提取物，排除药典的索氏提取法，根据文献报道[9-10]，本试验选取了醇提正丁醇萃取氨试液洗涤和甲醇超声提取方法。通过试验，超声提取的样品在30分钟能够有效提取完全，醇提正丁醇萃取氨试液洗涤法提出的样品用水饱和正丁醇萃取3次（25，25，20 m L）能够萃取完全，氨试液洗涤，使样品处于碱性环境中，更有利于人参皂苷成分的溶出[3]，也许是含量略高于超声提取的原因，具体机制需进一步研究，该样品处理最终确定为醇提正丁醇萃取氨试液洗涤。

[1]卫生部药品标准（中药成方制剂第四册）[S].北京：人民卫生出版社.1989.

[2]郭强.人参五味子冲剂质量标准研究[J].中医临床研究，2015，7（4）：16-18.

[3]付娟，李家春，张海弢，等.HPLC-ELSD法同时测定益心舒片中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量[J].广东药学院学报，2015，31（1）：62-65.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版）一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：8.

[5]林庆新.HPLC法测定人参三七颗粒中人参皂苷Rg1、Re、Rb1和三七皂苷R1的含量[J].中国药师，2013，16（10）：1527-1529.

[6]陆继伟，于建，陈曦，等.复方丹参片中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1、Re、Rb1的HPLC法测定[J].中国医药工业杂志，2012，43（12）：1027-1030.

[7]吴和珍，李婷婷，李菁，等.高效液相色谱法测定益智宁颗粒中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量[J].湖北中医药大学学报，2012，14（2）：25-27.

[8]杨雨，郑斯文，金银萍，等.人参皂苷的提取分离方法研究进展[J].江苏农业科学，2014，42（5）：214-217.

[9]郭汉文，沙东旭.HPLC-ELSD法测定人参茎叶皂苷胶囊中人参皂苷Rg1、Re的含量[J].中国药师，2013，16（4）：546-547.

[10]杨丽颖，郭伟英.HPLC-ELSD法同时测定益心宁神片中5种成分的含量[J].中药材，2015，38（12）：2619-2622.

Simultaneous Determ ination of Contents of Three Ginsenosides in Ginseng Schisandrae Particles by HPLC

Wu Junhong1，Wu Wenzhong2（1 Zhumadian Institute for Food and Drug Control，Henan Zhumadian 463000，China；2 The First Affiliated Hospital of Shenzhen University，Guangdong Shenzhen 518035）

Objective：To develop a HPLC method for simultane determination of the contents of ginsenoside Rg1，ginsenoside Re and ginsenoside Rb1in ginseng fruit.M ethods：HPLC was performed on agilent eclipse XDB-C18column（4.6 mm×250 mm，5μm）w ith a mobile phase of acetonitrile-water aqueous solution by gradient elution.The detection wavelength was 203 nm，while the flow rate was 1.0 mL/min，and the column temperature was 30℃.Results：Good linear relationships were obtained w ithin the range of 0.160～3.200μg（r=0.999 7），0.216～ 4.320μg（r=0.999 9）and 0.274～ 5.480μg（r=0.999 3）for Ginsenoside Rg1，Ginsenoside Re and ginsenoside Rb1，while the average recovery rates were 98.63% （RSD=1.13%），98.26% （RSD=1.17%）and 98.74%（RSD=1.07%），respectively.Conclusion：This method is simple，accurate，specific，reproducible and may be used for simultaneous determination of contents of three Ginsenosides in ginseng fruit.

Ginseng Schisandrae Particles；Ginsenoside Rg1；Ginsenoside Re；Ginsenoside Rb1；HPLC

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.11.004

中华医学会美能皮肤病学研究基金（2012031206）

吴军红，男，主管药师。研究方向：中药检验及质量标准研究。E-mail：48042557@qq.com

吴文中，男，博士，主任医师、教授。主要从事Th细胞在银屑病发病机制中的作用及复方甘草酸苷对HaCaT细胞增殖和相关因子表达影响的临床和实验研究工作。通讯作者E-mail：wzwucn@163.com

（2016-06-03）