乙酸铜对银鲳幼鱼急性毒性及抗氧化酶活性的影响

张鼎元，曹潇，郭春阳，童巧琼，徐善良

1. 宁波大学海洋学院，宁波 315211 2. 宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波 315211



乙酸铜对银鲳幼鱼急性毒性及抗氧化酶活性的影响

张鼎元1，曹潇1，郭春阳1，童巧琼1，徐善良2,*

1. 宁波大学海洋学院，宁波 315211 2. 宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室，宁波 315211

为评价乙酸铜对银鲳的安全性及毒性效应，采用静水急性暴露实验，研究了8个乙酸铜浓度梯度(0、0.150、0.206、0.282、0.387、0.531、0.729、1.00 mg·L-1)对银鲳幼鱼的急性毒性，以肝脏和鳃组织的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH—PX)以及谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活性为指标研究乙酸铜对银鲳幼鱼的毒理作用，并进行安全评价。结果表明，高浓度乙酸铜会对银鲳幼鱼产生了较大的毒性，48 h和96 h-LC50分别为0.898 mg·L-1、0.264 mg·L-1，安全质量浓度为0.026 mg·L-1；不同浓度乙酸铜胁迫下银鲳幼鱼组织中的SOD、CAT、GSH-PX和GST活性均表现为低浓度被诱导而高浓度受抑制的规律，与乙酸铜浓度呈抛物线型剂量效应关系，此外，肝脏中4种抗氧化酶活性普遍高于鳃组织。研究发现，乙酸铜胁迫对抗氧化酶的影响，可以反映银鲳幼鱼机体的受损状况，其中SOD可较灵敏地指示早期低浓度的铜污染。

乙酸铜；银鲳幼鱼；急性毒性；抗氧化酶

铜离子是生物生长发育所必需的微量元素，在提供营养、肠道吸收、生长繁殖和增强机体抵抗力等方面具有不可替代的作用，但是铜过量也会对蛋白质和酶产生毒害作用[1]。近年来，重金属污染日趋严重，其中铜俨然成为水环境的主要污染物之一。乙酸铜是水产养殖中应用最广泛的药物之一，在治疗鱼类白点病上有着良好的效果。但目前对乙酸铜的毒性效应研究不足，使得生产上因用药不当而造成养殖鱼类大量死亡的事故时有发生，因此需要对乙酸铜毒性效应进行深入研究。鱼类的急性毒性试验是研究药物对鱼类毒性强度的常用方法，抗氧化酶又是生物体氧化胁迫和损伤的主要标志物[2]，也是当前重金属在水产动物毒理学上研究的热点之一。

银鲳(Pampus argenteus)隶属鲈形目，鲳科，鲳属，是我国重要的海洋经济鱼种之一，主要分布在我国东海北部及黄海南部[3]。目前，国内对银鲳的繁殖、生长、营养、饵料等方面已进行了相关研究[4-7]，但有关重金属对银鲳毒性方面的研究很少。本文以人工养殖的银鲳幼鱼为实验对象，分析了乙酸铜对银鲳幼鱼的急性毒性，同时也测定了急性暴露试验后银鲳幼鱼肝脏及鳃组织中4种抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-PX和GST)活性的变化，旨在了解乙酸铜对银鲳幼鱼的急性毒性及对鱼体抗氧化酶活性的影响，为银鲳养殖中的安全用药提供理论依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验用鱼及条件

银鲳幼鱼由宁波象山鱼得水水产养殖公司提供，试验用鱼体长(6.2±0.15) cm，体质量(4.3±0.15) g。在容积为100 L的聚乙烯塑料桶内进行试验，试验前银鲳幼鱼在桶中暂养适应5 d，每天定时投喂5#“鱼宝”饲料(产自日本林兼产业株式会社)，试验前停食1 d。本试验采用二级沙滤海水，pH值为8.01±0.3，盐度为27，水温为(25±1) ℃，DO为(6.35±0.25) mg·L-1。

1.2 主要仪器和试剂

751-GW紫外分光光度计、冷冻离心机(GL-166-11型)等。乙酸铜试剂为分析纯，SOD试剂盒、CAT试剂盒、GSH—PX试剂盒、GST试剂盒、考马斯亮蓝总蛋白试剂盒、标准蛋白均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 试验方法1.3.1 急性毒性试验

参照《鱼类急性毒性试验方法》[8]，包括预试验以及正式试验。经预实验得到24 h和96 h银鲳幼鱼全部存活、全部死亡的乙酸铜浓度范围。再按等对数梯度设计7个乙酸铜浓度组，分别为0.150、0.206、0.282、0.387、0.531、0.729和1.000 mg·L-1，并设1个对照组，每个梯度3个平行，每平行10尾幼鱼。给药后按时观察并记录实验组银鲳幼鱼的活动状态，中毒症状以及死亡数量，及时捞出死鱼，玻璃棒触及尾部无反应即视为死亡。每天换水时更换新的药液，实验持续96 h。统计24 h、48 h、72 h和96 h的死亡尾数。毒性实验结束后，从各浓度组每个平行中取鱼2尾，置于冰盘中迅速解剖取肝脏和鳃组织保存液氮中待测。

1.3.2 酶液制备及酶活性的测定

将用冻存的组织于低温下解冻，用预冷的生理盐水冲净，然后加入4倍体积预冷生理盐水匀浆后，用冷冻离心机于4 ℃、2 500 r·min-1条件下离心10 min，取上清液置于4 ℃下保存，24 h内测定完毕。总蛋白含量、SOD、CAT、GSH-PX和GST的测定分别按照南京建成生物研究所的考马斯亮蓝总蛋白试剂盒、SOD(酶标法)、CAT(可见分光法)、GSH-PX(可见分光法)和GST(可见分光法)说明书测定。

1.4 数据处理

用SPSS16.0对所得数据进行分析统计，采用直线内插法[9]求算48 h及96 h的半致死浓度(48 h-LC50及96 h-LC50)，安全浓度SC=96 h-LC50×0.1[10-12]。并采用单因子方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比较法对不同浓度组间进行差异显著性检验，同一浓度不同组织间差异显著性检验采用t检验(P<0.05为差异显著)。

2 结果(Results and analysis)

2.1 银鲳幼鱼的中毒症状

银鲳幼鱼在不同浓度的乙酸铜实验组中的表现如下：在最高浓度组，银鲳幼鱼很快出现应激反应，具体表现为游速加快，脱离鱼群，独自进行无规律的游动，鳃盖开合频率加快，6 h后有4尾鱼逐渐失去平衡能力，在桶的上层侧翻游动，12 h后身体僵直，沉入桶底，此时鳃盖继续保持开合状态。随着时间的推移，沉入桶底的银鲳幼鱼偶尔又会挣扎游动，不久再次沉底，经过几次反复，24 h后9尾死亡；对于低浓度组受试的幼鱼而言，中毒的时间会有所延迟，但是中毒的症状相同。

2.2 乙酸铜对银鲳幼鱼的急性毒性

对各试验组中的受试银鲳幼鱼死亡情况进行统计，计算得到24 h、48 h、72 h和96 h死亡率和半致死浓度(LC50)以及安全浓度(SC)，结果见表1。结果显示，除了对照组之外，银鲳幼鱼在其余浓度实验组中均出现死亡的情况，死亡率随着乙酸铜浓度的增大以及实验时间的延长而显著递增(P<0.05)，呈较为明显的剂量-效应和时间-效应关系。用直线内插法得出，48 h和96 h乙酸铜对银鲳幼鱼的半致死浓度LC50分别为0.898和0.264 mg·L-1，安全浓度为0.026 mg·L-1。

2.3 乙酸铜对银鲳幼鱼肝脏及鳃组织超氧化物歧化酶活性的影响

图1为银鲳幼鱼在不同浓度乙酸铜中鳃组织和肝脏的SOD活性变化。结果显示，银鲳幼鱼鳃组织中SOD活性明显低于肝脏，鳃组织中SOD活性在不同浓度的乙酸铜条件下变化不明显，但在肝脏中变化较大，总体呈现出先升高后降低的变化趋势，两者的SOD活性均在乙酸铜浓度为0.15 mg·L-1时达到最大值，分别为301.61和67.13 U·mg-1，其中肝脏SOD活性为对照组的5倍，而鳃组织的SOD活性只为对照组的1.5倍。之后随着乙酸铜浓度的增加肝脏和鳃组织SOD活性随之降低，均在乙酸铜最高浓度组达到最小值，分别为38.32 U·mg-1和36.17 U·mg-1，均显著低于对照组(P<0.05)。

2.4 乙酸铜对银鲳幼鱼肝脏及鳃组织过氧化氢酶活性的影响

图2为银鲳幼鱼在不同浓度乙酸铜中鳃组织和肝脏的CAT活性变化。结果显示，银鲳幼鱼肝脏和鳃组织中的CAT活性与SOD相比，表现出更为明显的先升后降的趋势，两者在乙酸铜浓度为0.387 mg·L-1时达到最大值，分别为1 293.02 U·mg-1和735.26U·mg-1，均显著高于对照组(P<0.05)，分别达到对照组的5.7和3.1倍。当乙酸铜浓度增加到0.531 mg·L-1时，肝脏中的CAT活性下降明显且仅为最高值的25%；当乙酸铜浓度为1 mg·L-1时肝脏的CAT活性最低，为159.02 U·mg-1，与对照组差异显著(P<0.05)。而鳃组织CAT活性在浓度0.729 mg·L-1组达到最小值，为224.99 U·mg-1，也显著低于对照组(P<0.05)。

图1 不同浓度乙酸铜胁迫48 h对银鲳幼鱼鳃和肝组织SOD活性的影响注：上标第一个字母不同表示不同浓度组的显著性差异(P< 0.05)，第二个字母不同表示不同组织间的显著性差异(P<0.05)。下同。Fig. 1 Effects of copper acetate on SOD activity in juvenile Pampus argenteus after 48 h exposureNote: If the first letters are different, it denotes significant difference in different concentration groups (P< 0.05); if the second letters are different, it denotes significant difference in different organs (P< 0.05). The same below.

表1 乙酸铜对银鲳幼鱼急性毒性试验结果

图2 不同浓度乙酸铜胁迫48 h对银鲳幼鱼鳃和肝组织CAT活性的影响Fig. 2 Effects of copper acetate on CAT activity in juvenile Pampus argenteus after 48 h exposure

图3 不同浓度乙酸铜胁迫48 h对银鲳幼鱼鳃和肝组织GSH-PX活性的影响Fig. 3 Effects of copper acetate on GSH-PX activity in juvenile Pampus argenteus after 48 h exposure

图4 不同浓度乙酸铜胁迫48 h对银鲳幼鱼鳃和肝组织GST活性的影响Fig. 4 Effects of copper acetate on GST activity in juvenile Pampus argenteus after 48 h exposure

2.5 乙酸铜对银鲳幼鱼肝脏及鳃组织谷胱甘肽过氧化酶活性的影响

图3为银鲳幼鱼在不同浓度乙酸铜中鳃组织和肝脏的GSH-PX活性变化。和SOD、CAT及GST活性相比银鲳幼鱼肝脏中GSH-PX活性变化较小，两者均在乙酸铜浓度为0.282 mg·L-1时达到最大值，分别为403.02和86.93 U·mg-1，均显著高于对照组(P<0.05)，其中肝脏GSH-PX活性达到对照组的3倍，而鳃组织的GSH-PX活性为对照组的1.5倍。之后肝脏和鳃组织GSH-PX活性又随着乙酸铜浓度的增加而降低，均在乙酸铜浓度为0.729 mg·L-1时达到最小值，为104.05和28.11 U·mg-1，分别为最高值的25%和32%，均显著低于对照组(P<0.05)。

2.6 乙酸铜对银鲳幼鱼肝脏及鳃组织谷胱甘肽巯基转移酶活性的影响

图4为银鲳幼鱼在不同浓度乙酸铜中鳃组织和肝脏的GST活性变化。银鲳幼鱼鳃组织中GST活性也明显低于肝脏，而且随着乙酸铜浓度的增加，肝脏和鳃组织中的GST活性同样也呈现明显的先升后降的趋势。当乙酸铜浓度达到0.531 mg·L-1时，肝脏及鳃组织的GST活性首次低于对照组，此时鳃组织的GST活性达到最小值，仅为6.99 U·mg-1，为对照组的80%。两者均在乙酸铜浓度为0.206 mg·L-1时达到最大值，分别为141.83 U·mg-1和33.85 U·mg-1，均显著高于对照组(P<0.05)，分别达到对照组的4.98和3.84倍。

3 讨论(Discussion)

3.1 乙酸铜对银鲳幼鱼的致毒效应及安全浓度评价

铜作为生物体的必需元素之一，同时也具有很强的毒性，在其浓度过高时会对生物体产生严重的毒性影响。陈光芸等[13]等报道肝脏中积累的大量铜盐会抑制许多酶的活性，从而损伤肝功能甚至导致肝坏死，同时铜盐会降低血红蛋白含量，破坏鳃丝结构，这与实验中银鲳幼鱼的中毒症状相一致。在水产养殖上，乙酸铜作为一种杀虫剂发挥着重要的作用，尤其是可以替代硝酸亚汞和孔雀石绿这类禁用药来治疗海水鱼的小瓜虫病。本试验结果显示，乙酸铜对银鲳幼鱼的安全质量浓度为0.026 mg·L-1，明显低于生产推荐使用量(0.7～1.0 mg·L-1)，表明银鲳幼鱼对乙酸铜的耐受性非常低。因此，在使用乙酸铜防治“白点病”时要严格控制乙酸铜的药浴时间，以免引起银鲳中毒死亡。

3.2 乙酸铜对银鲳鳃及肝脏抗氧化酶活性的影响

机体凭借一系列抗氧化酶构建防御体系，抗氧化酶可以反映重金属离子对养殖动物的毒害程度并维持机体自由基动态平衡，减少氧自由基对细胞组织的损伤[14-18]。本实验结果显示，鳃组织的抗氧化酶活性总体上要显著低于肝脏组织，这与孔祥会等[19]、高静等[20]等研究锯缘青蟹(Scylla serrata)和斑马鱼(Danio retio)抗氧化酶得出的结论相一致，这是因为肝脏是生物体代谢活动的中心，为了保证肝脏中物质和能量代谢的高效进行，拥有一套较为完善的抗氧化系统，可以防止肝脏受损。

一些研究表明，抗氧化酶活性的变化与污染物的浓度具有相关性[21]。本研究结果表明，4种不同抗氧化酶的活性在不同浓度乙酸铜条件下均表现出相似的规律，即低浓度的乙酸铜对抗氧化酶活性起诱导作用，而高浓度的乙酸铜对抗氧化酶活性起抑制作用，符合毒性试验中较常见的抛物型剂量效应关系，王凡等[22]、张林宝等[23]等对牙鲆(Paralichthys olivaceus)和菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)抗氧化酶的研究中也得出同样的结论。此外，对水生动物而言，铜离子浓度对抗氧化酶活性的影响表现为低浓度诱导，高浓度抑制，这与其他重金属离子对抗氧化酶活性的影响相类似[24]。Stebbing[25]把这种现象定义为生物的“毒物兴奋效应”，而鲁双庆等[26]则认为低浓度的Cu2+诱导细胞产生大量的自由基，从而导致抗氧化酶活性的升高，高浓度Cu2+会增加自由基反应速度，使得那些未被及时清除的自由基损害细胞并破坏其结构，加速细胞的衰老，最终导致抗氧化酶的活性降低。

银鲳幼鱼受乙酸铜暴露后4种抗氧化酶的活性变化均为抛物线型剂量效应关系，这与万敏等[17]对皱纹盘鲍的研究结果一致。但是江天久等[27]对近江牡蛎的研究发现，重金属离子对鳃组织SOD活性的诱导曲线呈非抛物线型，这可能与物种间差异有关。

谭树华等[28]指出不同生物对污染物均有一个耐受阈值，超过了这个耐受阈值表明污染物对生物机体产生损伤，此时机体抗氧化酶的活性开始降低，这也是生物发生中毒反应的前兆[29]。而本研究结果表明，SOD、CAT、GSH-PX和GST各自对应Cu2+的耐受阈值各不相同，分别为0.150、0.387、0.282、0.206 mg·L-1，可以发现SOD对Cu2+的耐受阈值最低，即SOD对Cu2+更加敏感，可以较灵敏地指示早期水体中低剂量的Cu2+污染，张红霞等[16]在研究重金属离子对日本蟳抗氧化酶的影响时也得到相似的结论，程敏红等[30]利用乙酸铜和阿维菌素对斜带石斑幼鱼进行试验，结论也与本文基本一致。SOD被认作是机体防御自由基侵害的首道防线[31]，贾秀英等[32]也指出SOD活性可以作为鱼类逆境生理的一个生化指标，因此，在监测早期水体Cu2+污染时应首选SOD作为指示目标。

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Acute Toxicity of Copper Acetate and Its Effects on Antioxidant Enzyme Activity of Pampus argenteus

Zhang Dingyuan1, Cao Xiao1, Guo Chunyang1, Tong Qiaoqiong1, Xu Shanliang2,*

1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China 2. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology (Ningbo University), Ministry of Education, Ningbo 315211, China

Received 10 March 2016 accepted 5 May 2016

Copper acetate is a common fisheries drug which can be used for the control of parasitic diseases of fish. In order to evaluate the toxic effects and the safety of copper acetate on Pampus argenteus, an acute exposure experiment of copper acetate on Pargenteus was carried out by a static biological test method. According to the results of preliminary experiments, we set eight concentration gradients (0, 0.150, 0.206, 0.282, 0.387, 0.531, 0.729 and 1.00 mg·L-1) of acute exposure experiment. The activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-PX) and glutathione S-transferase (GST) in liver and gill served as the indicators to study toxicological effects of copper acetate on P. argenteus. The results showed that the LC50of copper acetate in 48 h and 96 h were 0.898 mg·L-1and 0.264 mg·L-1, respectively. The safe concentration of copper acetate for juvenile P. argenteus was 0.026 mg·L-1. Activities of SOD, CAT, GSH-PX and GST were induced at the low concentration of cooper acetate, whereas were inhibited at the high concentration. In addition, the activities of four antioxidant enzymes in liver was higher than that of gill. The changes of the antioxidant enzyme activities (SOD, CAT, GSH-PX, GST) could reflect the damage degree of P. argenteus by copper acetate stress, and the SOD activity can indicate low concentration copper pollution in the early stage.

copper acetate; Pampus argenteus; acute toxicity; antioxidant enzyme

国家星火计划项目(2015GA701007)；宁波市重大科技专项(2015C110003)

张鼎元(1992-)，男，研究生，研究方向为海水鱼类健康养殖，E-mail: 543840166@qq.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: xushanliang@nbu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160310001

2016-03-10 录用日期：2016-05-05

1673-5897(2016)4-280-07

X171.5

A

简介：徐善良(1962—)，男，硕士，教授，主要研究方向海水鱼类苗期营养和健康养殖，发表学术论文60余篇。

张鼎元, 曹潇, 郭春阳, 等. 乙酸铜对银鲳幼鱼急性毒性及抗氧化酶活性的影响[J]. 生态毒理学报，2016, 11(4): 280-286

Zhang D Y, Cao X, Guo C Y, et al. Acute toxicity of copper acetate and its effects on antioxidant enzyme activity of Pampus argenteus [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(4): 280-286 (in Chinese)