三氯生和三氯卡班对两栖动物蝌蚪的急性毒性

高昆，陈娟，李圆圆，刘春，秦占芬

1. 河北科技大学 环境科学与工程学院，石家庄 050018 2. 中国科学院生态环境研究中心 环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京 100085



三氯生和三氯卡班对两栖动物蝌蚪的急性毒性

高昆1,2，陈娟2，李圆圆2，刘春1,，秦占芬2

1. 河北科技大学 环境科学与工程学院，石家庄 050018 2. 中国科学院生态环境研究中心 环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京 100085

三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)是个人护理品中常用抗菌剂，在水体中普遍存在，但目前其对两栖动物的毒性研究仍较少。本研究以黑斑蛙蝌蚪和非洲爪蛙蝌蚪为受试生物，研究TCS和TCC对蝌蚪的急性毒性。将处于第一个蝌蚪发育期的黑斑蛙蝌蚪(Gosner 26期)和非洲爪蛙蝌蚪(NF 46期)分别暴露于系列浓度的TCS和TCC，测定其对蝌蚪的半数致死浓度(96 h-LC50)。结果发现，TCS对黑斑蛙蝌蚪和非洲爪蛙蝌蚪的96 h-LC50分别为441 μg·L-1和280 μg·L-1；TCC对黑斑蛙蝌蚪和非洲爪蛙蝌蚪的96 h-LC50为252 μg·L-1和217 μg·L-1。这些数据显示TCS和TCC对两种蝌蚪的毒性较高，且对非洲爪蛙蝌蚪毒性均略高于对黑斑蛙蝌蚪的毒性，整体来看TCC的毒性略高于TCS。

三氯生；三氯卡班；黑斑蛙；非洲爪蛙；蝌蚪；急性毒性

三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)是2种常添加于个人护理品中的抗菌剂[1]，在护理品中TCS的含量通常在0.1%～0.3%[2-3]，TCC的含量可以达到2%[4]。据估计2014年中国的TCS使用量约为100 t[5-7]，并且呈现逐年上升的趋势。TCS和TCC主要通过生活污水排放进入水体。研究显示，在北美、欧洲、澳洲、亚洲的河口、河流和湖泊中都有这些污染物的检出，一般浓度在ng·L-1水平，部分河流中浓度高达μg·L-1[3, 8]，沉积物中浓度达μg·g-1水平[9-11]。在污水处理厂附近的鱼类等水生生物体内，甚至人类尿液、血液、母乳中也有TCS和TCC的检出[12-14]。由于持续排放，TCS和TCC在环境中的存在及对生物体的不良影响值得关注。

有资料显示，TCS、TCC对啮齿类动物、鱼类、藻类有一定的影响并产生毒性效应。如大鼠皮肤注射TCS的半致死剂量LD50为5 000 mg·kg-1，大鼠口服TCS的半致死剂量LD50为4 500～5 000 mg·kg-1[15]；TCS对日本青鳉鱼仔鱼和成鱼的96 h-LC50分别为600 μg·L-1和1 700 μg·L-1；对斑马鱼胚胎和成鱼的96 h-LC50为420 μg·L-1和340 μg·L-1[16]；对黑头呆鱼成鱼的96 h-LC50为260 μg·L-1[17]；TCC对海洋小球藻、眼点拟微绿球藻、球形棕囊藻和东海原甲藻4种微藻的96 h-EC50分别为108 μg·L-1、63 μg·L-1、61 μg·L-1和58 μg·L-1[18]。从已有数据来看，TCS和TCC对水生生物(鱼类、藻类)的毒性高于对陆生生物的毒性，对同类生物(如鱼类)的毒性存在较大的种属差异。两栖动物介于水生与陆生动物之间，既能活跃在陆地上，又能游动于水中。两栖动物蝌蚪生长在水环境中，皮肤具有高渗透性，对水体污染物十分敏感。Palenske等[19]曾研究TCS对49期非洲爪蛙蝌蚪的急性毒性，报道96 h-LC50为259 μg·L-1。TCS对其他种属两栖动物的急性毒性如何目前还少有研究，而且没有关于TCC对两栖动物急性毒性的数据。

黑斑蛙是我国分布最广的本土两栖物种之一，隶属两栖纲、无尾目、蛙科、侧褶蛙属。本文旨在研究TCS和TCC对处于第一个蝌蚪发育期的黑斑蛙蝌蚪(Gosner26期)[20]的急性毒性，并与对非洲爪蛙蝌蚪(NF46期)[21]的急性毒性比较，为合理使用三氯生类杀菌剂及其相应的环境管理提供科学依据。

1 材料与方法( Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

仪器和设备：蛙类诱导繁育设备(本实验室研发)；尼龙纱网；500 mL烧杯。

试剂：三氯生(CAS NO. 3380-34-5；98%，东京化成工业朱式会社，日本)；三氯卡班(CASNO.101-20-2；98%，梯希爱化成工业发展有限公司，上海)；人绒毛膜促性腺激素(HCG，北京欣生科科技有限公司，中国)；注射用促黄体激素释放激素(LHRH，Sigma，美国)。

1.2 试验生物

黑斑蛙蝌蚪：成年黑斑蛙饲养在水陆两栖的玻璃缸中，每天清洗。水温(24±1) ℃，模拟自然光照射，明暗光周期为12 h:12 h。成蛙每天喂食面包虫1次。成年雌蛙注射2.5 μg LHRH(以0.6%的盐水配制)和300 IU的HCG；成年雄蛙注射2.5 μg LHRH和150 IU的HCG，然后放入蛙类诱导繁育设备中，诱导其抱对产卵。受精卵在水温(24±1) ℃明暗光周期为12 h:12 h的环境下孵化，胚胎发育至26期的蝌蚪，用于急性毒性试验。

非洲爪蛙蝌蚪：本实验室饲养的非洲爪蛙成年雌蛙和雄蛙，分养于盛有去氯自来水的玻璃缸中，水温(22±1) ℃，明暗光周期为12 h:12 h。成蛙喂食1:1配比的猪肝和商品饲料，喂食2 h后换水，1周2次。用质量分数为0.6%的盐水配制HCG溶液，非洲爪蛙雌蛙皮下注射300～500 IU，雄蛙注射200～300 IU，将雌雄蛙放于产卵容器中，置于黑暗安静的环境中让其抱对，12 h左右即可产卵。受精卵在水温(22±1) ℃、明暗光周期为12 h:12 h的环境下孵化，胚胎发育至46期的蝌蚪，用于急性毒性试验。

1.3 蝌蚪急性毒性试验

TCS和TCC分别以800 μg·L-1和1 000 μg·L-1为最高浓度，设置6个浓度暴露组进行预试验。随机选取10只蝌蚪放于盛有300 mL暴露液的烧杯中，设置3个平行，每隔24 h换液，清除死亡个体并记录死亡数，实验持续96 h。

根据预试验结果设置浓度范围，进行正式试验。TCS对黑斑蛙蝌蚪的系列暴露浓度为330 μg·L-1、363 μg·L-1、399 μg·L-1、439 μg·L-1、483 μg·L-1、531 μg·L-1；非洲爪蛙蝌蚪的系列暴露浓度为103 μg·L-1、135 μg·L-1、175 μg·L-1、228 μg·L-1、296 μg·L-1、384 μg·L-1、500 μg·L-1。TCC对黑斑蛙蝌蚪的系列暴露浓度为101 μg·L-1、152 μg·L-1、228 μg·L-1、342 μg·L-1、513 μg·L-1、770 μg·L-1；非洲爪蛙蝌蚪的系列暴露浓度为45 μg·L-1、68 μg·L-1、101 μg·L-1、152 μg·L-1、228 μg·L-1、342 μg·L-1、513 μg·L-1、770 μg·L-1。每个处理设置3个平行，暴露试验在500 mL烧杯中进行。每个烧杯中盛有300 mL暴露液，随机投放入10尾蝌蚪。每隔24 h换液，观察蝌蚪生命状态，记录死亡数，并清除死亡个体，试验持续96 h。

1.4 统计分析

每天详细记录每个烧杯内蝌蚪死亡数及蝌蚪异常情况；以受试化学品的浓度对数值为自变量(x)，以相应浓度下蝌蚪累积死亡率为因变量(y)，采用SPSS数据处理软件，使用Probit进行回归分析，建立“剂量-效应”线性方程，并计算LC50值及其95%置信区间。如果试验数据不适于用标准方法计算LC50，以不引起死亡的最高浓度和引起100%死亡的最低浓度的几何平均值为最终的LC50。

2 结果( Results)

通过预试验设定黑斑蛙蝌蚪正式试验浓度范围，26期黑斑蛙蝌蚪暴露于TCS、TCC的范围分别为330～531 μg·L-1，101～770 μg·L-1。TCS和TCC暴露后黑斑蛙蝌蚪在24 h、48 h、72 h和96 h的死亡率情况如图1。

溶剂对照组均无蝌蚪死亡，显示试验质量控制良好。黑斑蛙蝌蚪急性毒性结果显示，26期黑斑蛙蝌蚪暴露于TCS 24 h后，439 μg·L-1浓度下的蝌蚪出现死亡，存活的蝌蚪出现游动缓慢或沉于缸底等行为异常现象，531 μg·L-1浓度下的蝌蚪全部死亡；26期黑斑蛙蝌蚪暴露于TCC 24 h后，342 μg·L-1浓度下的蝌蚪出现死亡，72 h后770 μg·L-1浓度下的蝌蚪全部死亡。TCS在363 μg·L-1的浓度下，对黑斑蛙蝌蚪没有明显的毒性作用，而TCC在342 μg·L-1浓度时毒性明显，96 h时死亡率为80%。比较96 h TCS和TCC各浓度下的致死率，可以更明显地看出，TCC对26期黑斑蛙蝌蚪的毒性高于TCS。

图1 三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)对26期黑斑蛙蝌蚪的96 h内致死率Fig. 1 Mortality of Pelophylax nigromaculatus tadpoles (Gosmer stage 26) following exposure to triclosan (TCS) and triclocarban (TCC) within 96 h

图2 三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)对46期非洲爪蛙蝌蚪的96 h内致死率Fig. 2 Mortality of Xenopus laevis tadpoles (NF stage 46) following exposure to triclosan (TCS) and triclocarban (TCC) within 96 h

通过预试验设定非洲爪蛙蝌蚪正式试验浓度范围，46期非洲爪蛙蝌蚪暴露于TCS、TCC的范围分别为103～500 μg·L-1，45～770 μg·L-1。TCS和TCC暴露后非洲爪蛙蝌蚪在24 h、48 h、72 h和96 h的死亡率情况如图2。

非洲爪蛙蝌蚪急性毒性结果显示，46期非洲爪蛙蝌蚪暴露于TCS 24 h后，175 μg·L-1浓度下的蝌蚪出现死亡，存活蝌蚪游动缓慢或沉于缸底，500 μg·L-1浓度下的蝌蚪死亡率为70%；46期爪蛙蝌蚪暴露于TCC 24 h后，101 μg·L-1浓度下的蝌蚪出现死亡，72 h后770 μg·L-1浓度下的蝌蚪全部死亡。TCS在103 μg·L-1的浓度下，对非洲爪蛙蝌蚪没有明显的毒性作用，而TCC在101 μg·L-1浓度时毒性明显，96 h时死亡率为30%。上述结果表明TCC对46期非洲爪蛙蝌蚪表现出比TCS更强的毒性，与26期黑斑蛙蝌蚪的急性毒性结果相一致。

TCS和TCC对26期黑斑蛙蝌蚪、46期非洲爪蛙蝌蚪半致死浓度LC50如表1、表2所示，TCS、TCC对26期黑斑蛙蝌蚪的96 h-LC50分别为441 μg·L-1、252 μg·L-1；TCS、TCC对46期非洲爪蛙蝌蚪的96 h-LC50分别为280 μg·L-1、217 μg·L-1。比较TCS 、TCC对黑斑蛙蝌蚪的LC50值，发现TCC在48 h、72 h、96 h的LC50值低于TCS的LC50；同样比较TCS 、TCC对非洲爪蛙蝌蚪的LC50值，发现TCC在24 h、48 h、72 h、96 h的LC50值低于TCS的LC50。这表明TCC在对黑斑蛙蝌蚪和非洲爪蛙蝌蚪的毒性试验中都表现出了比TCS更明显的毒性。

3 讨论(Discussion)

本文研究了TCS和TCC对26期黑斑蛙蝌蚪和46期非洲爪蛙蝌蚪的急性毒性。比较了TCS对26期黑斑蛙蝌蚪的96 h-LC50(441 μg·L-1)、46期非洲爪蛙蝌蚪的96 h-LC50(280 μg·L-1)；TCC对26期黑斑蛙蝌蚪的96 h-LC50(252 μg·L-1)、对46期非洲爪蛙蝌蚪的96 h-LC50(217 μg·L-1)。由于目前没有化学品对蝌蚪急性毒性的分级标准，我们参考《化学农药环境安全评价试验准则》中关于农药对天敌两栖动物急性毒性的分级标准[22]，即：LC50≤0.1 mg·L-1为剧毒，0.1 mg·L-1< LC50≤1.0 mg·L-1为高毒，1.0 mg·L-1< LC50≤10 mg·L-1为中毒，LC50> 10 mg·L-1为低毒，对TCC和TCS的毒性等级进行了大致划分，认为它们都属高毒化学品。整体来看TCC的毒性略高于TCS，且TCS、TCC对非洲爪蛙蝌蚪的毒性略大于黑斑蛙蝌蚪。

表1 三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)对黑斑蛙蝌蚪的急性毒性

表2 三氯生(TCS)和三氯卡班(TCC)对非洲爪蛙蝌蚪的急性毒性

有研究报道，TCS对NF41、49、54、66期的非洲爪蛙蝌蚪的96 h-LC50分别为343 μg·L-1、259 μg·L-1、443 μg·L-1、664 μg·L-1[19]，TCS对日本青鳉鱼仔鱼和成鱼的96 h-LC50分别为600 μg·L-1和1 700 μg·L-1；对斑马鱼胚胎和成鱼的96 h-LC50为420 μg·L-1和340 μg·L-1，对黑头呆鱼成鱼的96 h-LC50为260 μg·L-1，按照危险化学品鱼类急性毒性分级试验方法分级标准[23]，属于高等毒性化学品。本文研究结果显示TCS、TCC对非洲爪蛙蝌蚪和黑斑蛙蝌蚪都为高毒。这些结果表明，TCS、TCC对黑斑蛙蝌蚪和非洲爪蛙蝌蚪的急性毒性与对鱼类的急性毒性相当。与对鼠类的毒性不同，TCS对大鼠的LD50为5 000 mg·kg-1，按照我国化学品急性毒性分级标准[24]，属低毒类化学品。由此看来，对鼠类具有低毒性的化学品，对水中生物却可能有较高的毒性。因此，使用多种生物种测试化学品的毒性对于全面认识化学品的生物安全性是必要的。

有研究表明，三氯生类杀菌剂主要通过污水排放进入环境，污水中和地表水中都有分布。一般地表水中的TCS和TCC污染水平在ng·L-1，从我们的研究数据来看，TCS和TCC对黑斑蛙蝌蚪和非洲爪蛙蝌蚪产生急性毒性的浓度要比环境浓度高1个或2个数量级。虽然如此，三氯生类杀菌剂仍然存在长期低剂量暴露的风险。本研究测定了TCS和TCC在实验室条件下对2种两栖动物的急性毒性水平，此结果只能从一个侧面反映2种抗菌剂对生态环境的毒性效应，而难以全面准确地反映出其实际毒害风险。已有文献报道了TCS和TCC在体内和体外实验中产生了内分泌干扰效应[25-30]，但是其作用机理仍不明确。因此，完全有必要对其环境行为、生态毒性和作用机理开展全面深入的研究。

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Acute Toxicity of Triclosan and Triclocarban to Amphibian Tadpoles

Gao Kun1,2, Chen Juan2, Li Yuanyuan2, Liu Chun1,*, Qin Zhanfen2

1. College of Environmental Science and Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang050018, China 2. State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China

Received 29 February 2016 accepted 11 March 2016

Triclosan (TCS) and triclocarban (TCC) are broad-spectrum antimicrobial agents used in personal care products. They have become ubiquitous in aquatic environment due to its wide use. However, information concerning their toxicities to amphibians is limited. This study aimed to investigate acute toxicities of TCS and TCC to Pelophylax nigromaculatus tadpoles and Xenopus laevis tadpoles. P. nigromaculatus (Gosner stage 26) and X. laevis (NF stage 46) at the first tadpole developmental stage were exposed to series of concentrations of TCS and TCC. Median lethal concentrations (LC50) for 24 h, 48 h, 72 h and 96 h were calculated. We found that 96 h-LC50for TCS to P. nigromaculatus tadpoles and X. laevis tadpoles were 441 μg·L-1and 280 μg·L-1, respectively, while 96 h-LC50for TCC to P. nigromaculatus tadpoles and X. laevis tadpoles were 252 μg·L-1and 217 μg·L-1, respectively. The data show that TCS and TCC have relative high toxicity to P. nigromaculatus tadpoles and X. laevis tadpoles, with higher toxicity to the latter. The toxicity of TCC to tadpoles is slightly higher than that of TCS.

triclosan; triclocarban; Pelophylax nigromaculatus; Xenopus laevis; tadpoles; acute toxicity

国家自然科学基金项目(21377153)；中国科学院战略性先导科技专项(B类)(XDB14040102)

高昆(1990-)，女，硕士，研究方向为环境毒理学，E-mail: 15832139933@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: liuchun@hebust.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160229001

2016-02-29 录用日期：2016-03-11

1673-5897(2016)4-226-06

X171.5

A

简介：刘春(1976—)，男，博士，教授，主要从事水污染控制和环境生物技术研究工作。

高昆, 陈娟, 李圆圆, 等. 三氯生和三氯卡班对两栖动物蝌蚪的急性毒性[J]. 生态毒理学报，2016, 11(4): 226-231

Gao K, Chen J, Li Y Y, et al. Acute toxicity of triclosan and triclocarban to amphibian tadpoles [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(4): 226-231 (in Chinese)