基于气相色谱技术的普洱熟茶7572挥发性物质指纹图谱建立及应用

宁井铭，张正竹，宛晓春

(安徽农业大学，茶树生物学与资源利用国家重点实验室，安徽 合肥，230036)



基于气相色谱技术的普洱熟茶7572挥发性物质指纹图谱建立及应用

宁井铭，张正竹，宛晓春*

(安徽农业大学，茶树生物学与资源利用国家重点实验室，安徽 合肥，230036)

普洱熟茶是由毛茶经发酵加工而成，花色品种多，加工企业对于不同花色品种普洱茶的质量控制主要依赖感官审评，缺乏量化的标准。采用气相色谱技术，从图谱的整体性出发，应用系统聚类和主成分分析等方法对色谱图进行综合分析，建立了普洱熟茶7572挥发性物质数字化指纹图谱和特征指纹图谱。结果表明，利用夹角余弦和重叠率比较不同品种普洱茶气相色谱相关系数，可以实现对7572与7692和7452普洱熟茶鉴别。这为茶产品质量控制和鉴别提供一种量化的方法。

气相色谱；普洱茶；指纹图谱；鉴别

普洱熟茶是以云南大叶种(Camelliasinensis(Linn) var. assamica (Masters) Kitamura)晒青毛茶为原料经特殊发酵后加工而成的[1]。在发酵的过程中，晒青毛茶在湿热、微生物和酶等共同作用下，内含成分发生了酶促氧化、裂解等一系列化学变化，毛茶中原有的一些挥发性物质组成也发生了变化，1,2,3-三甲氧基苯(1,2,3-trimethoxy，benzene)和1,2,4-三甲氧基苯(1,2,4-trimethoxy，benzene)等具有陈香味的成分出现，使发酵后的普洱熟茶具有典型的陈香味。目前，对于普洱熟茶不同花色品种质量控制主要采取人工感官审评的方式，感官审评由于受到多种人为因素的影响，具有一定的不确定性，从而导致不同花色品种普洱茶趋向于同质化，如何对不同花色品种普洱熟茶产品实现量化的评价，开发出更多的新产品，是加工企业面临的重要问题。

指纹图谱是指物质经适当处理后，在一定的试验条件下，得到的能够代表其化学特征的谱图[2]，具有整体性特点，目前已在环境保护、食品评价、中药质量控制和种子等领域得到广泛的应用[3-7]，将指纹图谱与计算机结合可用于对药品的质量控制[8-9]。色谱作为一种分离技术与方法已有百年历史。近年来，国内外学者相继开展了利用液相色谱构建乌龙茶[10]、绿茶[11-12]指纹图谱研究。但是利用气相色谱(gas chromatography,GC)技术构建普洱茶挥发性物质指纹图谱未见相关报道。

本研究利用气相色谱检测茶叶中挥发性物质，采用气相色谱技术从指纹图谱的整体性出发，采用多种方法计算指纹图谱的相似度，通过系统聚类和主成分分析等识别方法和模式，对普洱茶熟茶的挥发性物质色谱进行分析，建立普洱熟茶标志性产品7572挥发性物质数字化指纹图谱。以挥发性物质相似、容易混淆的7692和7452这两个熟茶产品为比较对象，实现对不同品种普洱熟茶鉴别，为茶叶的量化评价提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验采用的普洱熟茶由云南省勐海茶业有限责任公司提供，共14批，由于普洱熟茶产品规格较多，本研究选用普洱熟茶的标志性产品7572为研究对象。产品年份及批次详见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 供试样品溶液的制备

挥发性物质的提取采用同时蒸馏萃取(simultaneous distillation and solventextration,SDE)法提取普洱茶中挥发性成分，取茶样30.0 g置于1 L圆底烧瓶中，加入400 mL水，同时加入1 mL癸酸乙酯(50 mg/L)作为内标；在萃取瓶中加入30 mL乙醚(先重蒸)置于45℃水浴中。装置连接后，缓慢加热至烧瓶微沸(一直保持微沸)，回流2 h。回收乙醚溶液中加入5 g无水硫酸钠，4 ℃冰箱静置过夜，脱水12 h，用N2将回收乙醚浓缩至1 mL，4 ℃保存备用，所得香精油用于组分分析。

表1 样品的规格及加工时间

注：601表示该产品2006年第一批，加工时间约为2006.1，其他类同。

以顺氧化芳樟醇(linalool oxide cis)、反氧化芳樟醇(linalool oxide trans)、芳樟醇(linalool-L)、1,2,3-三甲氧基苯(1,2,3-trimethoxy，benzene)和1,2,4-三甲氧基苯(1,2,4-trimethoxy，benzene)5种标准品进行定性，仅统计匹配度和纯度大于800(最大值1 000)的鉴定结果。采用峰面积归一化法进行定量，确定不同茶样中各组分的相对含量。

1.2.2 色谱条件的建立

GC/MS分析在Shimaszu QP 2010气-质联用仪上进行，分离柱为30 m × 0.25 mm × 0.25 μm DB-5石英毛细管柱。载气为氦气，流速1.0 mL/min，不分流。条件：60 ℃保持2 min，以4 ℃/min 升温至200 ℃， 保持4 min，以1 ℃/min 升温至210 ℃，保持4 min，再在17 min内升温至升温至270 ℃，保持7 min，进样口温度270 ℃，连接口温度270 ℃。

在200 ℃温度下运行，电子轰击源电压70 eV，色谱扫描范围从质/荷比40至600，每次扫描0.3 s，间隔0.2 s；光电倍增管(PMT)电压230 V，GC/MS界面温度280 ℃。

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 精密度试验

取样品，按1.2.2方法制备供试样，取样品溶液连续5次进样，研究色谱方法的精密度，所得指纹图谱的主要色谱峰相对峰面积的相对标准偏差RSD(relative standard deviation)均小1.1%，相对保留时间的RSD均小于1.8%，符合要求。

1.2.3.2 重复性试验

取样品5份，分别按1.2.2方法制备供试样，取样品进样，研究色谱方法的重现性，所得指纹图谱的主要色谱峰相对峰面积的RSD均小1.0%，相对保留时间的RSD均小于1.6%，符合要求。

1.2.3.3 稳定性试验

取样品，按1.2.2方法制备供试样，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，研究色谱方法的稳定性。所得指纹图谱的主要色谱峰相对峰面积的RSD均小1.4%，相对保留时间的RSD均小于1.6%，符合要求。

1.2.5 数据分析

所有测量数据进行至少进行3次以上。利用Data Processing System软件(V9.50 DPS技术公司，中国)进行数据统计分析，利用Origin 7.5(OriginLab公司)进行绘图。

2 结果与分析

2.1 多元化指纹图谱建立

普洱熟茶7572在1.2试验条件下，其色谱峰较容易辨认，以顺氧化芳樟醇、反氧化芳樟醇、芳樟醇、1,2,3三甲氧基苯和1,2,4三甲氧基苯5种标准品对其他挥发性物质位置进行确定。对于相同样品中信息量差异较大的样品，利用标准品对样品进行确认。相同保留时间内色谱峰的漂移，根据标准品位置漂移进行定性。本研究中70 min以后的色谱峰较小，无法辨认，选择70 min以前的色谱峰建立指纹图谱，普洱熟茶气相色谱图如图1所示。

图1 普洱熟茶7572,7452和7692挥发性物质色谱图Fig.1 Volatile substances chromatograms of 7572, 7452 and 7692 Puer ripe teas

在色谱图上选择一色谱峰，该峰为所有样品所共有，且位于色谱图较中心位置和具有较高的强度，将其指定为参考峰，在此基础上求出所有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。标准图谱的确定采用共有模式中的平均矢量法，求出待测峰i的相对面积。将样品中各组分的相对保留时间值a按大小排列，并在每个a值下标出该组分的相对面积Sr，再将不同样品中具有相同a值的Sr做比较分析，以各样品的相对保留时间值(a)和相对峰面积(Sr)构建普洱熟茶GC/MS色谱指纹图谱，如表2所示，顺氧化芳樟醇、反氧化芳樟醇、芳樟醇、1,2,3三甲氧基苯和1,2,4三甲氧基苯，这5种标准品在数字化图谱中色谱峰号分别为11、12、13、19和21号。表中无对应的相对面积Sr时表示该样品不具有该a值的色谱峰。以标准指纹图谱为参考，分别求出各样品与标准图谱的重叠率、相关系数、夹角余弦和共有峰数目。

表2 普洱熟茶7572挥发性物质数字化指纹图谱

注：Ma：总峰数；Nb:共有峰数,S:相对峰面积总和(%)；W:特征峰相对面积总和；Y：重叠率。下同。

2.2 指纹图谱的分析

从表2可以看出，普洱熟茶7572色谱指纹图谱中面积较大的色谱峰有41个，其中有38个色谱峰为普洱熟茶所共有，这说明7 572这个产品与其它熟茶之间在挥发性物质组成和含量上存在着差异。在相同的保留时间内7 692和7 452均出现38个色谱峰。7572平均相对峰面积为13.73，标准偏差仅为0.89，7 692和7 452相对峰面积总和分别为12.02和12.75，小于7572。

在普洱熟茶数字化指纹图谱中，利用聚类分析的方法找出29个色谱峰，它们的相对总面积占总面积的92%以上，与全图谱的相似度也在90%以上，因此29个色谱峰可以作为判别普洱熟茶挥发性物质的群体特征峰，这些色谱指纹图谱为普洱熟茶样品100%共有峰，是熟茶挥发性物质的主要组成成分，是普洱熟茶的挥发性物质特征指纹图谱(图2，表3)。

图2 普洱熟茶7 572挥发性物质特征指纹图谱Fig.2 Characterization fingerprint of volatile substances of 7 572 Puer ripe tea

由表3可知，在29个普洱熟茶特征图谱出峰的保留时间内，7 692和7 452均出现色谱峰28个，相对峰面积总和小于7 572。1,2,3三甲氧基苯和1,2,4三甲氧基苯，这两种物质具有典型的陈香味，且这两种挥发性物质占到特征峰总面积的10%以上，芳樟醇占特征峰总面积的2.67%(图3)。

表3 普洱熟茶7 572挥发性物质数字化特征指纹图谱

图3 7 572与7 692、7 452熟茶主要挥发性物质比较Fig.3 Comparison main volatile substances of 7 572, 7 692 and 7 452 Puer ripe teas

2.3 普洱熟茶挥发性物质色谱指纹图谱的应用

2.3.1 相似度分析

以各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为因子，建立普洱熟茶GC/MS数字化指纹图谱。按照上述方法，12批7572样品及7692和7452的相关系数、夹角余弦和重叠率如表4所示。

从表4可知，熟茶7572样品色谱指纹图谱与标准图谱相比较，重叠率均为99%以上，相关系数达0.93以上，夹角余弦的相似度达到了0.97以上，而7692和7452这2个熟茶与标准指纹图谱比较重叠率为97%，相关系数分别为0.80和0.77，夹角余弦均小于或等于0.92，均远小于7572，从指纹图谱的相似度分析来看，7572熟茶与7692和7452在挥发性物质的组成和含量上差异性较大。

表4 不同种类熟茶相似度比较

2.3.2 系统聚类分析

在已建立的普洱熟茶数字化指纹图谱的基础上，对14个普洱熟茶数字化指纹图谱进行系统聚类。选用欧氏距离作为样品间相似性的测度，采用最短距离法聚类分析，结果如图4所示。当欧式距离取值为0.88及以上时，14个样品明显分为2大类，第一类为普洱熟茶7572，另一类为7692和7452。在系统聚类图上，我们可以看到，7572熟茶901、902和903三个批次与7692距离较近，这说明它们在挥发性物质的组成上差异性不大，2008年生产的7572熟茶产品大多批次聚在一起，这说明各批次间品质接近，质量稳定。

图4 普洱熟茶挥发性物质聚类分析结果Fig.4 Cluster analysis on aroma of Puer ripe teas

2.3.2 主成分分析

利用DPS数据处理软件对14个熟茶样品的数字化指纹图谱主成分分析结果见表5、表6。通过对主成分贡献的分析可知，普洱熟茶的主成分达到了11个。PC1～PC6的贡献率分别为29.44%、16.91%、15.06%、11.29%、9.21%和7.11%，其他成分的贡献率相对较小，从累计贡献率来看，取前6个主成分时，累计贡献率为89.01%，根据主成分分析原理，前6个主成分可以代表指纹图谱的全部信息(表5)。

表5 普洱熟茶挥发性物质的贡献率和累计贡献率

注：PC1～PC11——综合41个原始指标的前11个主成分。

由表6可知，第一主成分主要反映了色谱图中第6、11、21等号色谱峰信息，其中，11号色谱峰是顺-氧化芳樟醇，21号色谱峰是1,2,4三甲氧基苯，芳樟醇主要在第四主成分反映出来。第19号色谱峰1,2,3三甲氧基苯的信息主要在第二和第五主成分反映出来。普洱茶产品的最终用料是通过不同季节、不同等级、不同产地和不同发酵程度的原料拼配得到的，这需要保持长期的稳定性。不同产品的主成分分析结果应该是不同的。

表6 标准化特征向量

注：PC1～PC41—综合41个特征图谱原始指标的独立指标；X1～X41—样品模式中的41个面积较大的色谱峰。

2.3.4 二维排序和三维透视分析

在主成分分析的基础上，以14个普洱熟茶的第一主成分作纵坐标，以第二主成分为横坐标，作二维散布图，图5可以直观地显示出7572较为分散，但有一定的聚合度，不同年份及批次7572普洱熟茶在挥发性物质的组成上还存在一定的差异。7692和7452与7572在二维图上相距较远。普洱熟茶经过发酵后，其挥发性物质组成发生了很大的变化，生茶和晒青毛茶中主要挥发性物质芳樟醇被氧化成氧化芳樟醇，同时生成了新的具有陈香味物质，在挥发性物质的组分上远大于生茶，但没有一个占有主导地位。因而，普洱熟茶挥发性物质组分较多，但含量较低，在二维图上表现出较为分散。在二维图上可以看出，有一个批次的7572与其他的熟茶相距较远，结合图4可知，该熟茶是901、902和903的重合点。

图5 14个普洱熟茶挥发性物质第1、2主成分二维排序图Fig.5 Two-dimension scatter plot based on first and second primary components of volatile substances of 14 Puer ripe teas

以14个样品的第一主成分作X轴，以第二主成分作Y轴，以第三主成分作Z轴，作三维透视图。从图6可以直观地看出7692和7452在三维空间图上相距较远，7572熟茶各批次基本上聚合在一起。有1批次产品在三维图上与其他批次有一定的距离，结合图4聚类分析结果可知，这可能是901、902和903重合点。

图6 14个熟茶挥发性物质主成分三维图Fig.6 Three-dimension chart based on primary components of aroma of 14 Puer ripe teas

3 结论和讨论

利用GC/MS方法，建立了普洱熟茶7572挥发性物质数字化指纹图谱和特征指纹图谱，利用指纹图谱的相似度可以将7572与7692、7452这2个熟茶进行有效鉴别。系统聚类和主成分分析2种模式识别方法均可以对7572与7692、7452普洱熟茶产品进行量化识别。由于普洱产品花色较多，要实现挥发性物质指纹图谱在产品鉴定和质量保证上的应用，需要对不同的产品分别建立指纹图谱。

普洱熟茶挥发性物质组成较多，含量较低，不同批次7572产品挥发性物质组成上存在一定的差异性，其聚合度相对较低。茶叶中挥发性物质组成影响因素较多，用于建立指纹图谱样品的选择需要具有代表性，而且需要保持稳定性。

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Establishing fingerprints of volatile substances of 7572 Puér ripe tea based on gas chromatography technology

NING Jing-ming, ZHANG Zheng-zhu,WAN Xiao-chun*

(State key Laboratory Tea Plant Biology and Utilization,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

Puér ripe tea is prepared by fermentation of raw green tea. Puér ripe tea can be divided into many varieties depending on fermentation degrees. Sensory evaluation is the only way to distinguish the varieties. Quantitative evaluation is needed. This study used gas chromatography to analyze volatile substances of Puér ripe tea (7572). Puér ripe tea (7572) digital fingerprint and the characteristic fingerprint are established to perform quantitative analysis of different varieties teas. System clustering and principal component analysis method are used for a comprehensive analysis of chromatogram. By compare the correlation coefficient, 7572,7692 and 7452 can be distinguished. The cosine of the angle and the overlap rate are used in characterization of tea fingerprint. It provides a quantitative method to distinguish different varieties teas and control the quality of tea.

gas chromatography; Puér ripe tea; fingerprint; identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610029

博士，副教授(宛晓春教授为通讯作者,E-mail：xcwan@ahau.edu.cn)。

国家现代农业(茶叶)产业体系建设专项(CARS-23)；安徽省自然科学基金(1408085MC61)

2015-12-17，改回日期：2016-03-16