高盐稀态酱油生产过程中的生物胺变化规律

于金芝，徐峰，徐莹*

1(中国海洋大学 食品科学与工程学院，山东 青岛，266003)2(大连市疾病预防控制中心，辽宁 大连，116021)



高盐稀态酱油生产过程中的生物胺变化规律

于金芝1，徐峰2，徐莹1*

1(中国海洋大学 食品科学与工程学院，山东 青岛，266003)2(大连市疾病预防控制中心，辽宁 大连，116021)

采用丹磺酰氯柱前衍生高效液相色谱法测定4种市售高盐稀态酱油中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺8种生物胺的含量，并监测了其中一种酱油生产过程中生物胺含量和生物胺产生相关指标的动态变化。结果显示，市售酱油总生物胺含量差别较大，范围为102.87～760.28 mg/kg，但均以酪胺、组胺和苯乙胺为主。酱油发酵过程中，大部分生物胺表现出相似的变化趋势，即发酵前期快速升高，在50～60 d左右达到峰值，再逐渐降低，酪胺和组胺是酱油发酵过程中的主要生物胺，最高含量分别达到2 417.36 mg/kg和815.89 mg/kg。氨基酸态氮前期变化趋势与总生物胺含量变化基本一致，之后趋于稳定；pH值降低有利于生物胺的形成，最低时生物胺含量达到峰值。结果表明，在市售酱油和不同发酵时期酱油中生物胺的含量情况不容乐观，需加以研究与关注。

生物胺；酱油；高效液相色谱法；动态变化

酱油是以豆粕、小麦、麸皮等为原料，经多种微生物发酵制成的具有特殊色、香、味的调味品[1]。酱油是我国传统的发酵食品，原料中的各种物质在微生物酶的催化下水解成氨基酸等成分，不同成分之间相互组合、多级转化，造就了酱油独特的风味口感，但因为其发酵周期较长且过程复杂，就可能会产生一些潜在的有害物质，生物胺就是其中的一类。

生物胺是一类具有生物活性的低分子量含氮有机化合物的总称，在食品中主要是由微生物的氨基酸脱羧酶对游离氨基酸脱酸反应产生的[2]。生物胺广泛存在于食品尤其是酱油、酒类等发酵食品中，主要有组胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺和亚精胺[3]。生物胺对维持细胞正常的生理功能有一定作用[2]，但是，当机体摄入高浓度的生物胺时，会导致身体产生头痛、恶心、呼吸紊乱等过敏反应[3]。其中，组胺和酪胺的毒性最大。美国FDA对于水产品中组胺的含量限制为50 mg/kg[4]，将500 mg/kg定为危险水平，并且论证了所食用的鱼类中有超过1 000 mg/kg的组胺就会产生中毒[5]；口服酪胺超过100 mg会引起偏头痛，超过1 080 mg就会引起中毒性肿胀食[6]。

近几年对酱油中生物胺的研究逐步增多，但是主要集中于成品市售酱油中生物胺的检测。到目前为止，有关酱油发酵过程中生物胺含量的变化规律的报道还较少。有研究显示，在已检测的成品酱油中普遍存在8种生物胺，有少部分酱油中的总生物胺甚至超过了1 000 mg/kg[7-10]。酱油是我国以及亚洲范围内广泛食用的调味品，在人们的日常生活中占据重要地位，因此，有必要对其整个发酵过程中生物胺的形成和变化规律进行研究。本文在测定4种市售的高盐稀态发酵酱油中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺含量的基础上，监测了其中一种酱油生产过程中8种生物胺含量的变化规律，并分析了可能与生物胺产生相关指标的变化，以期为今后酱油发酵过程中生物胺关键控制点的确定提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

在青岛某超市随机购买保质期内的4个不同品牌的高盐稀态酱油，即A(山东省烟台市)、B(山东省烟台市)、C(广东省江门市)、D(山东省青岛市)，首次采样前未打开包装。不同时期的酱油发酵样品由青岛某酿造有限公司提供，取样于50mL无菌聚丙烯酰胺小瓶，-20 ℃冷冻待检测。

标准品组胺、腐胺、精胺和亚精胺以及衍生剂丹磺酰氯，购自Sigma公司；标准品色胺、苯乙胺、尸胺和酪胺，购自Aldrich公司；其中，组胺、腐胺和尸胺分别为组胺二盐酸盐、腐胺二盐酸盐和尸胺二盐酸盐形式。甲醇为色谱纯，购自Merck公司；水由Milli-Q超纯水系统制备；HCl、丙酮等其他化学试剂均为国产分析纯。

混合生物胺标准储备液：用0.1mol/L HCl将8种生物胺精确配成100 mg/L(均以生物胺的单体形式计)的标准储备液，密封后4℃避光保存。

混合生物胺标准应用液：用0.1 mol/L HCl将混合生物胺标准储备液分别稀释为1.00、2.50、5.00、10.00、15.00、25.00和50.00 mg/L，4 ℃避光保存。

Dns-Cl衍生剂：以丙酮为溶剂将Dns-Cl配制成10 mg/mL衍生剂，4 ℃避光保存。

pH11.0缓冲液：将0.5 mol/L NaHCO3和0.5 mol/L Na2CO3，按照体积比25∶6混合均匀，然后用Na2CO3调节pH至9.2，4 ℃保存。每50 mL上述缓冲液中加入16.65 g K2CO3，缓冲液的pH值即为11.0～11.1，必须现配现用。

1.2 实验方法

1.2.1 测定市售成品酱油中的生物胺含量

准确称取2.00 g酱油于10 mL离心管，加入6 mL 0.1 mol/L HCl，旋涡混合，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，取上清定容到10 mL，即为生物胺提取液。

生物胺衍生步骤：移取1.00 mL生物胺提取液于10 mL离心管，加入1.50 mL pH11.0的缓冲液，混合均匀；然后再加入1.00 mL Dns-Cl，40 ℃水浴暗反应1 h；加入0.20 mL脯氨酸溶液，混合均匀，室温保持1 h；加入3.00 mL正庚烷萃取，旋涡混合，分层后取1.00 mL上层有机相，40 ℃下氮气吹干；加入1.00 mL色谱纯甲醇溶解残留物，过0.22 μm有机膜，待上机测定。

表1 生物胺分析的梯度洗脱程序

高效液相色谱仪的测定条件：参照JIANG等[11]的方法并适当调整。Agilent 1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；色谱柱Capcell Pak C18MGⅡ(4.6 mm I.D.×150 mm，5 μm)，日本资生堂；流速0.80 mL/min；柱温35℃；进样体积20μL；紫外检测波长254 nm。洗脱程序见表1。

1.2.2 测定酱油发酵过程中生物胺含量变化

分别称取2.00 g酱油D的不同时期发酵样品于10 mL离心管，加入6 mL 0.1 mol/L HCl，漩涡混合，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，取上清于25 mL容量瓶，剩余沉淀再次加入HCl重悬，同样条件离心，合并上清液于容量瓶，定容，即为生物胺提取液。衍生步骤和测定条件见1.2.1。

1.2.3 pH值

使用PHSJ-3F数字pH计(上海精密科学仪器有限公司)测定。

1.2.4 氨基酸态氮含量

使用ZDJ-4A型自动电位滴定仪(上海仪分科学仪器有限公司)，采用甲醛滴定法测定发酵样品中的氨基酸态氮(AAN)含量，结果以mg/100g发酵样品表示[7]。

1.3 数据处理

每个样品设3个平行样，结果以(平均值±标准偏差)的形式表示；使用Origin Pro8.1软件作图。

2 结果与讨论

2.1 生物胺分析方法的确认

表2为色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺线性方程与相关系数，8种待测生物胺在1.00～50.00 mg/L的浓度范围内线性良好，相关系数R2均大于0.99。

表2 生物胺的线性方程与相关系数

图1A为生物胺标准品衍生后的液相色谱图，8种生物胺的峰形对称、尖锐，而且能达到较好的分离度；图1B是某酱油样品经0.1 mol/L的HCl提取、Dns-Cl衍生后的液相色谱图，前15 min主要用于杂质的分离，保留时间15～33 min之间，主要是8种待测生物胺的色谱峰，保留时间相对稳定，不会影响各生物胺的定性分析。

图1 生物胺标准品(A)和一种酱油(B)的液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of the derivatives of biogenic amines(A) and extracts of one soy sause (B)

2.2 4种市售酱油中生物胺含量分析

4种市售酱油产品中8种以及总生物胺含量见图2，所测产品普遍含有测定的8种生物胺，但不同品牌酱油的生物胺种类和含量差异较大。

酱油C、酱油A和酱油D含有较高浓度的生物胺，总生物胺浓度分别为760.28 mg/kg、684.80 mg/kg和328.27 mg/kg，而酱油B的生物胺含量相对较低，总生物胺浓度仅为102.87 mg/kg。酱油C含量最高的为酪胺(399.37 mg/kg)，其次为组胺(188.03 mg/kg)和苯乙胺(66.43 mg/kg)；酱油A含量最高的为组胺(336.50 mg/kg)，其次为酪胺(260.80 mg/kg)和苯乙胺(51.80 mg/kg)；酱油D含量最高的为酪胺(94.33 mg/kg)，其次为组胺(86.44 mg/kg)和苯乙胺(77.34 mg/kg)；而酱油B含量最高的亚精胺仅为40.27 mg/kg。由此可知，除了酱油B，酱油中普遍含有较高浓度的酪胺、组胺和苯乙胺，其他五种生物胺的浓度则相对较低。这与邹阳[8]、LU[9]等的报道基本一致。酱油中高含量的酪胺可能与酱油生产原料豆粕中高含量的酪氨酸有关。研究表明，酪胺和苯乙胺是由酱油生产过程中的肠球菌等微生物生成的[12]。也有研究表明，高含量的酪胺与腐胺和尸胺的含量比较高有关，也可能与酱油整个生产过程中的卫生状况有关[12]。

图2 市售酱油产品中生物胺含量Fig.2 Biogenic amines content of commercial soy sauces

过量的组胺摄入会使人体产生头晕、头疼、呕吐等症状，大部分关于生物胺的标准也是针对组胺，FDA规定水产品中组胺的限量标准为50 mg/kg[4]。由图2可知，检测的4种酱油中，有3种组胺含量远高于此标准，酱油A的组胺含量甚至达到336.50 mg/kg，这可能与酱油开放式的发酵环境以及发酵菌群组胺生成能力较强有关。有研究表明，酪胺含量超过100 mg/kg的食品会危害人体健康[2]。在测定的4个酱油样品中，有2个酱油产品的酪胺含量超过了100 mg/kg。生物胺中组胺对人类影响最大，其次是酪胺[14]，因此，有必要对酱油中的组胺和酪胺进行监测。有研究表明，食品中总生物胺含量大于1 000 mg/kg会对人体造成伤害[2]。由图2可知，所测4个酱油样品总生物胺的含量范围在102.87～760.28 mg/kg，均未超过1 000 mg/kg。

综上所述，8种生物胺在所测市售酱油中普遍存在，酱油发酵体系中的生物胺产生菌、丰富的游离氨基酸以及相对适宜的环境导致生物胺的大量产生。酱油具备独特的风味及丰富的氨基酸组成，是中国和亚洲其它很多国家日常使用的调味料，但是长期大量摄入生物胺会对身体造成较大的损害。因此，分析酱油发酵过程中生物胺的产生过程，可为今后酱油发酵过程中生物胺关键控制点的确定提供重要依据。

2.3 酱油发酵过程中生物胺含量变化

本研究分析了青岛某酱油不同发酵时期生物胺含量的变化，结果见图3。

图3 酱油发酵样品过程中生物胺含量变化Fig.3 Changes of biogenic amine content in soy sauce during different fermentation periods

色胺、腐胺：两种生物胺的变化趋势基本一致，在酱油发酵期的前14天，几乎检测不到，从第21天开始，含量急剧上升，分别在第54天和在第61天达到最高(分别为364.60 mg/kg和234.44 mg/kg)，之后快速下降，在第117天之后又缓慢上升，最终含量分别为50.82 mg/kg和60.35 mg/kg。

苯乙胺、酪胺：两种生物胺变化趋势极为相似，在酱油发酵前期几乎检测不到，从第21天开始，含量先缓慢上升，之后急剧上升，在第61天达到最高，分别为298.95 mg/kg和2417.36 mg/kg，之后呈先急后缓下降趋势，最终含量分别为24.59 mg/kg和111.67 mg/kg。酪胺是酱油发酵中期含量最高的生物胺，且远高于其它种类生物胺，最终浓度超出了FDA规定的100 mg/kg。

组胺：组胺在前期的变化与苯乙胺相似，在第61天含量达到最高，为815.89 mg/kg，最终浓度为535.00 mg/kg。组胺的含量仅次于酪胺，也超过了FDA的限量标准50 mg/kg。酪胺和组胺是酱油发酵体系中两种最主要的生物胺，这与成品酱油的生物胺含量一致。

尸胺：尸胺在整个发酵过程中含量变化最不明显，发酵前期含量在30 mg/kg上下波动，第60天之后，含量缓慢上升，最终含量为50.90 mg/kg。

亚精胺和精胺：两种生物胺前期变化整体呈上升趋势，分别在第117天和第214天达到最高，分别为93.90 mg/kg和269.88 mg/kg，亚精胺含量在第117天之后略有下降，而精胺含量一直上升。

酱油发酵过程中，总生物胺含量在前14天变化不明显，之后快速上升，在第49天超过1 000 mg/kg，达到1238.31 mg/kg，之后急剧升高，在第61天时达到最高浓度，为4 405.29 mg/kg，之后总生物胺含量急剧下降，在第117天时降至1 249.96 m/kg，第117天之后下降趋势缓慢，最终含量为1 187.63 mg/kg。在整个发酵过程中，酪胺和组胺的含量远高于其它6种生物胺，所以，酪胺和组胺的变化趋势在很大程度上决定了总生物胺的变化趋势。

酱油发酵前期生物胺含量未显著增加，可能与该时期体系中游离氨基酸含量较低有关。微生物产生的胞外酶将蛋白质等大分子物质水解为多肽、氨基酸等，此时可以产生氨基酸脱羧酶的微生物才可以利用游离氨基酸并且在适宜的条件下将其转化为生物胺。因此，在60天左右时，生物胺的总含量达到高峰。之后，总生物胺浓度逐渐下降，可能是因为发酵体系的环境不适合生物胺产生菌的生长，生物胺降解菌转而占据优势。影响生物胺生成的因素有很多，如原料中大豆的含量，微生物的组成，发酵周期等[15]，因此，生物胺的形成和变化规律是这些因素共同作用的结果。

2.4 酱油发酵过程中常规理化指标变化

如图4所示，氨基酸态氮含量在发酵前期变化不明显，之后快速升高，在第50天左右时达到峰值，之后趋于平缓，变化趋势与总生物胺含量基本一致，且达到峰值的时间稍早于生物胺达到峰值的时间。当酱油发酵体系中含有大量前体氨基酸时，可以产生氨基酸脱羧酶的微生物就会在适宜条件下将氨基酸转化为相应生物胺。氨基酸态氮在一定程度上反映了氨基酸的含量，因此，发酵过程中氨基酸态氮含量变化与生物胺的含量具有一定相关性[6]。

如图4所示，酱油发酵过程中体系的pH值变化趋势为发酵前期呈下降趋势，在第50天左右时降到最低，pH值约为5.3，之后缓慢上升，发酵结束最终pH约为5.9。pH值是影响酱油中生物胺产生的重要因素之一。KOESSLER等[16]研究表明，胺的形成是细菌为抵抗酸性环境的做出的生理反应[6]。有研究指出，细菌的氨基酸脱羧酶在酸性环境下活力更强，因此低pH值能提高细菌产生生物胺的能力[2]。由此可以推断，在酱油发酵体系pH值下降过程中，生物胺的含量逐渐积累，并在pH值降到最低之后达到峰值。

图4 酱油发酵过程中氨基酸态氮含量和pH值变化Fig.4 Changes of amino acid nitrogen content and pH in soy sauce during different fermentation periods

3 结论

本文采用Dns-Cl柱前衍生HPLC法同时测定了酱油中8种生物胺的含量。酱油中的生物胺以组胺、酪胺和苯乙胺为主，总生物胺的含量均超过了100 mg/kg。所测酱油发酵过程中色胺、苯乙胺、腐胺、组胺和酪胺的变化趋势基本一致，发酵前期明显升高，50～60 d左右时达到峰值，之后逐渐降低；尸胺含量在发酵过程中变化不大；亚精胺和精胺含量在发酵过程中逐渐上升并趋于稳定，无明显下降趋势；氨基酸态氮前期变化趋势与总生物胺含量变化基本一致，之后趋于稳定；pH值降低有利于生物胺的形成，最低时生物胺含量达到峰值。

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Analysis on the change rule of biogenic amines during the process of high-salt diluted soy sauce

YU Jin-zhi1,XU Feng2,XU Ying1*

1(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China) 2(Dalian Municipal Center for Disease Control and Prevention, Dalian 116021, China)

Eight biogenic amines including tryptamine, phenylethylamine, putrescine, cadaverine, histamine, tyramine, spermidine and spermine in commercial high-salt diluted soy sauce were determined by the high performance liquid chromatography using pre-column derivatization with dansylchloride. The changes of biogenic amine content and the related indexes in the fermentation process of one soy sauce were also studied. The results showed that the total content of eight biogenic amines in commercial soy sauce was ranged from 102.87-760.28 mg/kg. Tyramine, histamine and phenylethylamine were regarded as the main biogenic amines in the soy sauce. Most of the biogenic amines exhibited similar tendency of increase first and then decrease in the fermentation process of soy sauce with maximum values observed between fifty and sixty days. Histamine and tyramine were regarded as the main biogenic amines in the fermentation process of soy sauce, with highest contents of 815.89 mg/kg and 2 417.36 mg/kg, respectively. The content of amino acid nitrogen showed similar tendency with the total biogenic amines in early period of fermentation. The descending of pH was beneficial to the formation of biogenic amines, which peaked when pH reached its lowest value. The results suggested that the situation of biogenic amines in commercial soy sauce and the fermentation process was not optimistic, and needed more studies and attention.

biogenic amines;soy sauce;high performance liquid chromatography;dynamic change

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610008

硕士研究生(徐莹副教授为通讯作者,E-mail: xuy@ouc.edu.cn )。

十二五国家科技支撑计划项目(2015BAD17B02-1)；国家自然科学基金(U1406402-5)

2016-05-03，改回日期：2016-05-20