影响人血白蛋白Fv过滤时间的工艺研究

何勇，杨帆，夏润，丁洪波，赵云

(1.四川大学，四川成都610065；2.成都蓉生药业有限责任公司，四川成都610041）

影响人血白蛋白Fv过滤时间的工艺研究

何勇1，2，杨帆2，夏润2，丁洪波2，赵云1★

(1.四川大学，四川成都610065；2.成都蓉生药业有限责任公司，四川成都610041）

在利用压滤技术分离Fv时，时常会出现过滤时间长，Fv沉淀中液体含量高及沉淀冻存到温时间长的情况。经研究发现，上述情况主要受Fv制作时缓冲液添加速度及过滤时压滤机进液压强的影响。在其他工艺参数不变的情况下，改变缓冲液加液速度及进液压强。经多批次生产统计发现，在平均加液速度为36L/h及进液压强为160kPa时，能大幅缩短过滤时长，减少沉淀中液体含量，缩短沉淀冻存到温时间。此工艺对缩短生产周期，降低能耗有重要意义。

人血白蛋白；Fv；加液速度；进液压强；过滤时长

人血白蛋白是一种分子量小、表面积较大、具有高渗透压的蛋白质，对治疗失血性休克、严重烧伤、脑水肿、肝肾疾病血症有重要作用。人血白蛋白是血液制品的主要产品，也是血浆蛋白生产工艺主线的最终产物。目前人血白蛋白的分离及纯化应用最广泛的是低温乙醇法。多数血液制品生产企业采用改良的低温乙醇工艺Cohn6/9法或N/K（Nitschmann-Kistlcr）法[1]，利用压滤技术将固液分离得到人血白蛋白。压滤分离为深层过滤，即过滤介质是具有一定厚度的滤板，其内部为迂回曲折的结构，过滤中多使用助滤剂，其粒间隙也构成了曲折的结构[2，3]。过滤液通过滤板时，主要通过机械阻挡的方式捕捉固体成分。在实际生产中，利用压滤技术对制作完成的Fv进行过滤时，时常会出现过滤时间长，压滤机过滤板压高，吹干后滤饼中滤液多的情况，从而影响人血白蛋白中间体Fv沉淀的冷冻暂存及延长生产周期。通过研究发现，影响过滤压力和过滤时长的原因主要与Fv制作时缓冲液的加液速度和过滤时压滤机的进液压有关。

1　主要材料与设备

1.1主要设备

压滤机（FC.800.AC），购自EUROFILTEC公司；冰箱（MDF-U5412），购自SANYO公司；气动隔膜泵（PX2），购自WILDEN公司；蠕动泵（L/S），购自MASTER FLEX公司。

1.2主要材料

50P滤板，美国PAll公司；助滤剂硅藻土，临江益瑞石硅藻土有限公司；缓冲液，成都蓉生药业有限责任公司；健康人血浆，成都蓉生药业有限责任公司。

2　试验方法

2.1制备人血白蛋白

制备人血白蛋白的低温乙醇工艺如图1。

图1　白蛋白低温乙醇工艺

2.2缓冲液加液速度的控制

用蠕动泵添加缓冲液至反应罐中，由流量计读取加液速度，通过控制蠕动泵的转速控制加液速度[4]。

2.3过滤进液压强的控制

用气动隔膜泵传输制品至压滤机，由进液压力表读取进液压强，气动泵转速越快，压滤机进液压越高。通过调节气动泵转速控制进液压强[5]。

2.4过滤时间的检测

从Fv过滤开始计时，至滤液过滤完压滤机吹干结束为过滤时间。记录在不同的加液速度和过滤进液压下过滤所用的时间t（h）。

2.5沉淀冻存到温时间检测

在白蛋白生产过程中，常出现多批次的白蛋白中间体（Fv沉淀）用低温冰箱暂存后再合并精制的情况。过滤所得到的Fv沉淀用医用袋装好后放入低温冰箱，沉淀从-8℃冻存到-35℃所用时间即为沉淀冻存到温时间。记录不同的沉淀冻存到温时间t（h）。

2.6沉淀中液体含量的测定

过滤所得Fv沉淀重量为M（g），沉淀溶解后用双缩脲法测定蛋白浓度为C（g/L），溶解液体积V（L），由公式得出沉淀中液体含量（%）。

3　试验结果

3.1加液速度的影响

在其他工艺参数一致情况下，固定进液压强，以3个批次为同一组加液速度，统计在不同的加液速度下过滤时长，沉淀中液体含量及沉淀冻存到温时间的情况，如图2、3所示。

图2　加液速度对过滤时长及沉淀中液体含量的影响

图3　加液速度对沉淀冻存到温时间的影响

由图2、3得出，缓冲液的加液速度越快，制品过滤时间越短，沉淀中的液体含量低，沉淀冻存到温时间越短。其主要原因是缓冲液加液速度越快，越有利于制品中的蛋白形成较大的聚集体，在过滤时越大的聚集体越容易被滤板及滤饼拦截，所以过滤速度越快，得到的沉淀中液体含量越少，沉淀冻存到温时间越短。加液速度不能过快，由于缓冲液是由酸和乙醇混合而成，过快的加液速度会使添加的缓冲液不能及时的被分散导致局部蛋白变性。

3.2进液压强的影响

在其他工艺参数一致情况下，固定缓冲液加液速度，以3个批次为同一组过滤进液压强，统计在不同进液压强下过滤时长，沉淀中液体含量及沉淀冻存到温时间的情况，见图4、5。

图4　进液压强对过滤时长及沉淀中液体含量的影响

图5　进液压强对沉淀冻存到温的影响

由图4、5得出，进液压强过低或过高都会增加过滤时间。这主要是由于进液压强由气动隔膜泵控制，进液压强越低则气动隔膜泵的转速慢，相应的过滤速度越慢；进液压越高则气动泵的转速越快，相应的过滤速度越快。但50p滤板有其自身的过滤能力，过快的过滤速度会使制品堆积在滤板上，不利于疏松的滤饼形成，滤液不能顺利穿过滤饼，使后期过滤难度增加，进而延长过滤时间。所以应选择适中的进液压强，即160Kpa的进液压强。

3.3过滤时间

在其他参数一致的情况下，选择缓冲液加液速度为36L/h，过滤进液压强为160kPa，进行5个批次的平行验证，得到的结果如表1。

表1　过滤时间对沉淀中滤液含量和冻存到温时间的影响

过滤平均时间t=2.34h，过滤时间的标准差σ=0.024；沉淀中液体平均含量1.16%，沉淀中滤液含量标准差σ=0.024；沉淀冻存到温平均时间t=18.2h，沉淀冻存到温时间标准差σ=0.200。

4　讨论

结果表明：在其他工艺参数一致的情况下，缓冲液加液速度越快，过滤时间越短；过低和过高的进液压强都会延长过滤时间，只有在适中的进液压强下，过滤时间才最短。添加缓冲液越快，越有利于形成大块的聚合物；适中的进液压强有利于形成疏松的滤饼。制品中大块聚合物和疏松的滤饼更有利于过滤，在吹干压滤机时，液体更容易穿过滤饼，形成的沉淀液体含量低，从而缩短沉淀冻存到温时间。实验表明，在一定的缓冲液添加速度和进液压强下进行的平行验证，Fv过滤时间短，Fv沉淀液体含量低，Fv沉淀冻存到温时间短，且此工艺稳定性高，重现性好。

[1]浦奕奕．低温乙醇法在人血白蛋白工业化生产中的应用[J].考试周刊,2008,2(3):236-237.

[2]谭邦青,曾学清.压滤技术在低温乙醇法制备人血白蛋白工艺中的应用[J].中国生化药物杂志,2001,22(3):93-94.

[3]刘欣宴.人血白蛋白连续流压滤工艺研究[D].山东,山东大学：26-30.

[4] Kobayashi K． Summary of recombinant human serum albumin development[J]. Biologicals,2006,34(1):55-59．

[5]杨晓波,王晓雷,王峰．人血白蛋白提取工艺的对比分析与改进方案[J].生命科学仪器,2010,8(2):44-48．

Process Research on the Filtration Time of Fv in Human Albumin

He Yong1,2,Yang Fan2,Xia Run2,Ding Hong-Bo2,Zhao Yun1*
(1.Sichuan University,Sichuan Chengdu 610065; 2.Chengdu Rongsheng Pharmaceutical Co. Ltd.,Sichuan Chengdu 610041)

During filtering Fv with pressure filtration technique,if the filter time is too long,Fv precipitations with high liquid content and the precipitations freeze-stored to the specified temperature with a long time happen frequently .The study found that those were influenced by the speed of adding buffer in manufacturing Fv and the liquid inlet pressure. In the case of other parameters constant,the speed of adding buffer and the liquid inlet pressure were changed. The statistics with multi-batch of production showed that it could reduce the filtration time,the liquid content of precipitations and the time of precipitations freeze-stored to the specified temperature with the speed of adding buffer 36.0L/h and the liquid inlet pressure 160kPa. It has an important significance to reduce production time and energy consumption.

Human Albumin; Fv; Speed of Adding Buffer; Feed Pressure; Filtration Time

TQ464

A

2096-0387（2016）05-0033-03

何勇（1987-），男，四川成都人，硕士研究生，研究方向：分子生物学及其生物技术。

赵云（1965-），四川成都人，博士，研究方向：油科植物的遗传育种，分子生物学及其生物技术。