肉类食品的动物物种基因鉴别及等温扩增荧光（IAFT）快速检测技术的建立

王耕，张薇，陈安东，王振超

（北京晟泰勃科技有限公司，北京100097）

肉类食品的动物物种基因鉴别及等温扩增荧光（IAFT）快速检测技术的建立

王耕，张薇，陈安东，王振超

（北京晟泰勃科技有限公司，北京100097）

食品安全是国家公共安全的重要组成部分，直接影响人类健康、公共卫生和社会稳定。随着全球性食品安全事件的持续发生，食品安全问题日益严峻。因此，建立快速、有效、精确的肉类制品物种鉴定技术和快速检测方法已成为一项重大课题。基于此，根据分子生物学基因扩增技术发展趋势，集成核酸等温扩增核心技术，以等温扩增荧光快速检测技术为基础，收集不同的动物物种样品进行基因序列分析，确定靶基因序列，针对目的片段设计特异引物，组合新型DN A聚合酶，在特定温度条件下复制和扩增，并与传统PCR技术比较，筛选、优化、建立了灵敏度更高、扩增速度更快、特异性更强的肉类食品的动物物种基因鉴别SGI（Species gene identification）的等温扩增荧光（Isotherm al Am plification Fluorescent Technology，IAFT）快速检测技术，并取得阶段性成果，为食品安全的质控和监管提供必要的技术支撑，作为肉类食品及其制品的现场快速物种特异鉴定的检测手段。

肉类食品；等温扩增荧光技术；成分鉴定

随着欧洲“马肉风波”“苏丹红事件”“禽流感”“三鹿奶粉事件”等恶性食品安全事件的发生，食品安全监管的执行需要科学高效的检测手段作为依据。因此，建立一套准确、有效、现场应用的快速检测方法和体系，对维护人类健康和食品安全意义重大。

近年来，在动物肉类及其制品贸易中，不断出现以次充好、以假乱真的现象，不良商家用低价值的鸡、鸭、老鼠、狐狸肉等加入劣制味剂冒充牛羊肉谋取暴利，严重影响广大消费者的健康和权益。在国际市场上，相继出现以马肉和驴肉冒充牛肉进行销售的恶劣行为，食品安全问题日益严峻[1]。因此，快速、有效、准确地对畜禽肉类制品进行种属鉴定和快速检测方法的建立是一项重要的研究课题。

突发性食品安全事件，不仅需要准确有效的实验室检测手段，更需要建立和完善现场快速检测方法，以便在第一时间和事件现场完成快速检测，有效控制危害影响。目前，针对肉类食品动物物种基因鉴定的常规方法主要有常规PCR[2-4]和定量PCR技术[5-9]、ELISA技术[10]、近红外光谱检测[11]和色谱分析、等电聚焦、免疫扩散、DNA杂交[12]等。其中，核酸检测和抗原抗体检测方法灵敏度、特异性、准确性较高；理化检测法基于化学指标检测是一种间接检测法，具有一定局限性，需依赖配套设备在实验室操作，流程复杂，工作量大，对样本要求高。通过本研究建立现场快速检测方法和体系，为食品安全的质控和监管提供必要的技术支撑和科学的执法依据有实用意义。

1　材料与方法

1.1试验材料

试验材料为超市随机购买的猪、牛、羊、鸡和鸭肉和常规加工牛、羊、猪、鸭肉罐头、鸡肉火腿肠畜禽制品，以上述收集的动物物种样品进行基因序列分析，确定靶基因序列，作为引物设计的依据。

1.2试验试剂

IAFT反应试剂IMM购自英国Optigene公司；核酸快速提取试剂Fast Extraction kit来自北京晟泰勃科技有限公司；Buffer；Genesig Meat Speciation Kit；去离子无菌水。

1.3试验仪器

现场核酸快速抽提系统用于现场抽提、制备、混匀，STP Suitsys100；实时等温扩增荧光检测系统Genie；梯度PCR仪，DNA-T Tercyc；常规采样、加样工具。

1.4引物设计与合成

以收集不同的动物物种样品基因序列分析结果，经对各物种核酸序列分析和比对，选择各自保守区的特异性片段，设计、优化并合成引物，稀释备用。所设计引物为检测猪、牛、羊、鸡和鸭的引物组，每组包括FIP、BIP、F3、B3。

1.5样本核酸提取

取样100mg，破碎，据核酸快速提取试剂Fast Extraction kit要求抽提取上清备用。

1.6反应体系配置

IMM 15μL；引物FIP（40pmol/μL）、BIP（40pmol/ μL）、F3 Primer（5pmol/μL）、B3 Primer（5pmol/ μL），各1μL；样品4μL。

1.7程序设定

GenieⅡ程序设定：61℃，30min。

1.8特异性试验

每次加入5组引物，分批次加入生猪、牛、羊、鸡和鸭肉验证引物特异性。

1.9灵敏度试验

在牛肉中掺入猪肉，使猪肉含量分别为10%、1%、0.1%、0.01%和0.001%，各取100mg提取DNA，检测猪肉成分。

1.10实际样本检测

猪、牛、羊、鸭肉罐头和鸡肉火腿肠加工制品，提取DNA后检测，与PCR方法对比。

2　结果与分析

2.1特异性试验结果

按1.6中方法在8联管中1～5号孔分别加入猪、牛、羊、鸡和鸭肉引物和IMM（见表1），取猪肉据1.5提取DNA，取上清4μL加入1～5孔，按1.7设置程序，扩增，结果显示除1孔有扩增以外其他孔均无扩增和特异性溶解温度，同法验证牛、鸡、鸭、羊肉引物和反应体系特异性。

表1　各孔对应引物组

图1　特异性实验扩增曲线

图2　各引物对猪肉特异性实验扩增曲线

表2　特异性实验检测结果

图1和图2中，加入生猪肉样本后，只有猪引物对应的1孔出现特异性扩增，其余孔均无扩增。表2为试验结果，扩增时间9min，溶解温度为89.3℃。同法分别加入牛、羊、鸡、鸭肉样本，除对应孔有扩增外，其余孔均无扩增，判定为阴性，验证了各引物组的高度特异性。

2.2灵敏性试验结果

按1.5提取DNA，检测猪肉成分，结果见图3，随着猪肉成份含量降低，扩增时间相应变长，样本含量和扩增时间存在线性关系。且当猪肉含量0.01%时，扩增时间小于20min。验证IAFT法高扩增效率。

图3　灵敏性试验扩增结果

2.3实际样本鉴定结果

加工牛、羊、猪、鸭肉罐头、鸡肉火腿肠，按1.5提取DNA，每组样本使用IAFT法和PCR法做平行对比，验证样品中是否含猪、牛、羊、鸡、鸭肉成分。

2.3.1肉类食品动物物种等温扩增荧光检测技术建立

在牛肉罐头中未检出牛肉成分，仅有猪肉和鸡肉（见图4和表3）；羊、猪、鸭的罐头中分别只检出羊肉成分、猪肉成分、鸭肉成分（分别见图5～7和表4～6）；检测的鸡肉火腿肠中，只检出鸡肉成分（见图8和表7）。

图4　牛肉罐头检测扩增图

表3　牛肉罐头检测结果

图5　羊肉罐头检测扩增图

表4　羊肉罐头检测结果

图6　猪肉罐头检测扩增图

表5　猪肉罐头检测结果

图7　鸭肉罐头检测扩增图

表6　鸭肉罐头检测结果

图8　鸡肉火腿肠检测扩增图

表7　鸡肉火腿肠检测结果

2.3.2梯度PCR电泳结果

图9～13为PCR检测加工牛、羊、猪、鸭肉罐头、鸡肉火腿肠电泳图。表8数据验证了IAFT法和PCR法结果一致。

图9　牛肉罐头PCR检测结果

图10　羊肉罐头检测电泳图

图11　猪肉罐头检测电泳图

图12　鸭肉罐头PCR检测结果

图13　鸭肉火腿肠PCR检测结果

表8　PCR检测结果

综上所述，本研究通过对不同动物物种基因分析、比对、筛选确定靶基因序列的基础上，经优化样品前处理、引物设计，确立实验程序和规范，完成特异性试验、敏感性试验、实际样品鉴定并与相关常规方法比较，验证和建立了肉类食品的动物物种基因鉴别的快速检测技术。

3　讨论

近年来出现的各种核酸等温扩增技术[13，14]，对目的片段设计特异引物，使用新型DNA聚合酶在等温条件下复制和扩增，与传统PCR技术比较，更加灵敏、快速、特异，有多种结果分析和判定方法，如浊度法、钙黄绿素法、电泳法、实时荧光法。其中，浊度和钙黄绿素法是基于副产物的间接判定方法，准确性和特异性欠佳。电泳判定依赖实验室环境，易交叉污染，假阳性率高。

本研究以等温扩增荧光法（IAFT）为基础建立了肉类食品的动物物种基因鉴定体系，与传统PCR方法进行对比，其结果符合率达到100%。实验和应用证明，IAFT是一种快速准确的核酸检测技术，集成并融合了核酸等温扩增和实时荧光检测[15]，通过对产物做溶解曲线分析，对核酸进行快速定性或定量。所需设备简单、对样本质量要求较低、扩增和结果检测可同时完成，是样品采集、快速制备、实时检测、结果判定的现场核酸快速检测配套技术体系，经验证是一种准确、可靠、先进的分子生物学基因快速检测技术。融合了定量PCR的实时荧光检测技术和样本快速制备和抽提技术，适合于物种基因检测、食品卫生安全、进出境口岸检疫、疫情快速防控等领域的实验室或现场核酸快速检测。

4　结论

（1）集成核酸等温扩增核心技术，以等温扩增荧光快速检测技术为基础建立了肉类食品的动物基因鉴别及等温扩增荧光（IAFT）快速检测技术体系。

（2）经分析不同物种基因，确立靶基因序列并完成了引物设计，证明以等温扩增荧光技术进行肉类食品的动物基因鉴别，对于生物物种鉴别具有广阔的应用前景。

（3）经与传统的基因扩增技术进行比较和评价，表明等温扩增荧光快速检测技术不仅可以替代常规PCR法，且更为特异、敏感、精确、快速和便捷，适合于任何条件下的现场快速检测。

[1]何玮玲,黄明,张驰.食品中肉类成分种属鉴别技术研究进展[J].食品科学,2012,33(3):304-307.

[2] RH Yin,WL Bai,JM Wang,et al. Development of an assay forrapid identification of meat from yak and cattle using polymerase chainreactiontechnique[J]. Meat Science,2009,83(1):38-44.

[3] V Fajardo,I Gonzá lez,I Ló pez-Calleja,et al. Identificationof meats from red deer (Cervuselaphus),fallow deer (Damadama),androe deer (Capreoluscapreolus) using polymerase chain reaction targetingspecic sequences from the mitochondrial 12S rRNAgene[J]. MeatScience,2007,76(2):234-240.

[4] S Ghovvati,MR Nassiri,SZ Mirhoseini,et al. Fraud identificationin industrial meat products by multiplex PCR assay[J]. FoodControl,2009,20(8):696-699.

[5] NZ Ballin,KG Madsen. Sex determination in beef by melting curveanalysis of PCR amplicons from the amelogeninlocus[J]. Meat Science,2007,77(3): 384-388.

[6] I Martí n,T Garcí a,V Fajardo,et al. SYBR-green real-timePCR approach for the detection and quantification of pig DNA in feedstuffs[J]. Meat Science,2009,82(2):252-259.

[7] L Ines,Z J utta,B Hermann. Quantitative determination of commerciallyrelevant species in foods by real-time PCR[J]. InternationalJournal of Food Science & Technology,2007,42(3):336-341.

[8] V Fajardo,I Gonzá lez,I Martí n,et al. Real-time PCR fordetection and quantification of red deer (Cervuselaphus),fallow deer(Damadama),and roe deer (Capreoluscapreolus) in meat mixtures[J]. Meat Science,2008,79(2):289-298.

[9] CL Zhang,MR Fowler,NW Scott,et al. A TaqManrealtimePCR system for the identification and quantification of bovine DNAin meats,milks and cheeses[J]. Food Control,2007,18(9):1149-1158.

[10] MT Muldoon，DV Onisk，MC Brown，et al. Targets andmethods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs[J]. International Journal of Food Science and Technology,2004,39(8):851-861.

[11]杨志敏.近红外光谱技术快速鉴别原料肉产检的可行性研究[J].肉类研究,2011,25(2):25-28.

[12] JB Buntjer,A Lamine,N Haagsma，et al. Species identificationby oligonucleotide hybridisation: the influence of processing ofmeatproducts[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,1999,79(1): 53-57.

[13] T Nimitphak,W Kiatpathomchai,TW Flegel. Loop-mediated isothermal-amplification of DNA[J]. Nucleic AcidsRes,2000,28(12): E63

[14] K Nagamine,T Hase,T Notomi. Accelerated reaction by loopmediated isothermalamplification using loop primers[J]. Mol. Cell Probes,2002,16(3):223-229.

[15] CJ Smith,AM Osborn. Advantages and limitations ofquantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology[J]. FEMS Microbiology Ecology,2009,67(1):6-20.

Identification of Animal Species in Meat Food and Establishment of Rapid Detection Technology for Isothermal Amplification of Fluorescence (IAFT)

Wang Geng,Zhang Wei,Chen An-dong,Wang Zhen-chao
(Beijing Suntrap Science & Technology Co. Ltd.,Beijing 100097)

Food safety is an important part of the national public security,which directly affects human health,public health and social stability. With the global food safety incidents continue to occur,the food safety problem is increasingly severe. Therefore,the establishment of rapid,effective and accurate meat products species identification technology and rapid detection method has become a major issue. Based on this,according to the development trend of molecular biology gene amplification technology,integrated nucleic acid isothermal amplification core technology,based on the isothermal amplification fluorescence rapid detection technology,different animal species samples were collected for gene sequence analysis,the target gene sequence was identified,specific primers were designed for the target fragment,and the new DNA polymerase was combined to replicate and amplify under specific temperature conditions,and compared with the traditional PCR technology,screening,optimization and establishment isothermal amplification fluorescent (Isothermal Amplification Fluorescent Technology,IAFT) rapid detection technology that an animal species gene identification technology of meat products with higher sensitivity,faster amplification and stronger specificity SGI,and achieved initial results,to provide necessary technical support for the quality control and supervision of food safety,as a means of detection field of meat and its products for rapid identification of specific species.

Meat food; Isothermal amplification fluorescence technique; Component identification

TS251.7

A

2096-0387（2016）05-0021-06

王耕(1986-),男,陕西西安人，本科,工程师,研究方向:食品安全快速检。