不同冻存温度及时间对人血浆蛋白分离沉淀中蛋白质的影响

杨勇，丁洪波，唐建，王健美

（1.四川大学生命科学学院，四川成都610000；2.成都蓉生药业有限责任公司，四川成都610000）

不同冻存温度及时间对人血浆蛋白分离沉淀中蛋白质的影响

杨勇1，2，丁洪波2，唐建2，王健美1

（1.四川大学生命科学学院，四川成都610000；2.成都蓉生药业有限责任公司，四川成都610000）

《中国药典》2015年版中规定了蛋白沉淀应冻存于-30℃以下，并规定其有效期；但此处的规定仅针对“最终冻存温度”或“低温保存设备的设定温度”，并未对沉淀冻存降温过程、时间进行规定。但在实际生产过程中，对沉淀冻存时间、温度的统计过程中发现，FⅤ、FⅡ沉淀冻存过程的实际降温时间可能长短不同，在极端的情况下，可能超过48h的降温时间范围规定。为考察此种情况，开展了对冻存沉淀质量的影响试验。结果表明，FⅤ、FⅡ沉淀对较高冻存温度（-10℃）的最长耐受时间均大于为72h。

人血浆蛋白沉淀；冻存温度；冻存最长耐受时间

根据《中国药典》2015年版三部，对于蛋白沉淀的冻存温度，在“人血白蛋白”项目下，规定“2.1.4组分Ⅴ沉淀应冻存于-30℃以下，并规定其有效期”；在“静注人免疫球蛋白(pH4)”项目下，规定“2.1.3组分Ⅱ、组分Ⅱ+Ⅲ沉淀或组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀应冻存于-30℃以下，并规定其有效期”；在“乙型肝炎人免疫球蛋白”“破伤风人免疫球蛋白”等条目下，药典也作出了相同规定。《中国药典》2015年版三部仅规定了蛋白沉淀的“最终冻存温度”或“低温保存设备的设定温度”，并未对沉淀冻存降温过程、时间，或者可能发生的温度波动或回升进行规定[1]，故此项补充验证试验将根据公司实际使用的低温保存设备和实际生产运行情况对蛋白沉淀的冻存过程做更加详细深入的研究。

1　试验材料

MDF-U5412低温保存箱为日本三洋公司生产，可用于各种组织、细胞、微生物、血液制品和DNA样本的冷冻保存，是当今高端生物制药领域普遍使用的先进低温保存设备。三洋MDF-U5412低温保存箱用于组份FⅤ、FⅡ沉淀的冷冻保存，制冷温度最低可达-40℃，完全满足《中国药典》2015年版三部关于蛋白沉淀冻存温度的规定。

2　试验准备

根据统计实际生产过程数据，FⅤ、FⅡ沉淀在收集完毕后，经检测沉淀的温度大概在-5℃左右，放入温度已经达到-35℃的三洋MDF-U5421低温保存箱后，低温保存箱显示温度会升至-10℃左右，由于实验取得的10g左右的小样品，在放置进入低温保存箱后即立即进行热交换并迅速达到目标温度，在现有条件下无法对小样品模拟进行降温曲线的拟合[2]。故选取-10℃作为实际生产过程中冻存条件可能的最高温度，作为沉淀较高冻存温度下耐受性的最差温度条件，最低温度则设为-35℃。

3　试验方法与结果

3.1监测FⅡ沉淀溶解液纯度和分子大小分布、FⅤ沉淀溶解液纯度和多聚体含量

经日常检查，监测运行平稳，无故障。分别随机抽取3个批次的FⅡ和FⅤ沉淀样品，批号为M201503055、M201503056、M201503057。每批次组分样品各12份，每份10±2g。沉淀样品分别冻存于-10℃和-35℃条件下，将2种冻存温度下的沉淀在不同的存储时间（0、48、72h)后取出，进行外观检查确认后，对每一份加水至7倍沉淀质量的体积70±14mL充分搅拌溶解[3]，取2mL样品保存在2～8℃环境中待检。样品对应-10℃条件下不同时间编号为A0、A48、A72，样品对应-35℃条件下不同时间编号为B0、B48、B72。 FⅤ沉淀和FⅡ沉淀的质量指标为外观、纯度、多聚体含量及分子大小分布。对FⅡ沉淀溶解液纯度和分子大小分布、FⅤ沉淀溶解液纯度和多聚体含量进行检测，试验数据分别见图1和图2。

图1　试验抽样的3个批次FⅡ沉淀溶解液纯度及分子大小分布

图2　试验抽样的3个批次的FⅤ沉淀溶解液纯度及多聚体含量

由图1和图2可知，对于可接受标准，相较于在-35℃冻存的沉淀，在-10℃冻存的FⅤ或FⅡ沉淀外观一致，无明显色差；该冻存时间内的各批次间FⅤ或FⅡ沉淀溶解液纯度、多聚体含量及分子大小分布检测数据经T检验在α=0.05水平上无显著性影响（P＞0.05）。则可以认为在该保存时间内，-10℃冻存温度条件的FⅤ或FⅡ沉淀质量属性无明显变化。即说明在-10℃冻存条件下，FⅤ或FⅡ沉淀可以耐受该保存时间的冻存。

3.2蛋白沉淀对较高冻存温度的最长耐受时间

基于本次试验设计的FⅤ和FⅡ蛋白沉淀在-10℃冻存条件下，质量属性是否发生显著变化的最长时间（72h），作为蛋白沉淀对较高冻存温度（-10℃）是否耐受的最长耐受时间。

3.2.1冻存时间对蛋白品质影响

以B0为基准，B48列下的T检验的数据为-35℃冻存48h蛋白质量数据，B72列下的T检验的数据为-35℃冻存72h蛋白质量数据。所有B72列T检验P值均大于0.05（见图3），说明在95%置信度下，在-35℃下，冻存72h后的蛋白（FⅡ和FⅤ2种）的纯度、多聚体含量及分子大小分布与沉淀新制取（B0）时无显著性差异。

另外，所有B48列T检验P值均大于0.05（见图3），说明在95%置信度下，在-35℃下，冻存48h后的蛋白（FⅡ和FⅤ2种）的纯度、多聚体含量及分子大小分布与沉淀新制取（B0）时无显著性差异；此结论符合药典要求与我们的预期，从一定程度上证明了试验的准确性。

以上试验部分证明，在规定冻存温度下（-35℃），较长的冻存时间（72h）对球蛋白或白蛋白的品质无显著影响。

3.2.2冻存温度对蛋白品质影响

在FⅤ或FⅡ沉淀存放48h/72h，存放温度为-10℃/-35℃的条件下，以B48、B72为基准，所有B48和B72列T检验P值均大于0.05（见图3），说明在95%置信度下，在-10℃/-35℃存放48h/72h下的FⅡ和FⅤ蛋白的纯度、多聚体含量及分子大小分布在统计学意义上无显著影响。

3.2.3极端情况讨论

以A0为基准，做了极端情况试验，即在-10℃下将2种蛋白冻存72h，其质量数据检测结果与T检验值位于A72列下。所有A72列T检验P值均大于0.05（见图3），说明在95%置信度下，在-10℃下，冻存72h后的蛋白（FⅡ和FⅤ2种）的纯度、多聚体含量及分子大小分布与沉淀新制取（A0）无显著性差异。

以上部分试验证明较长冻存时间（72h）和较高冻存温度（-10℃）同时作用时，对无论球蛋白或白蛋白的品质在统计学意义上无显著影响。

图3　T检验P值

4　结论

较于在-35℃冻存的沉淀，在-10℃冻存的FⅤ、FⅡ沉淀外观一致，无明显色差；该冻存时间内的各批次间FⅤ、FⅡ沉淀溶解液纯度、多聚体含量及分子大小分布检测数据经T检验在α＝0.05水平上无显著性影响（P＞0.05），则可以认为在该保存时间内，-10℃冻存温度条件的FⅤ、FⅡ沉淀质量属性无明显变化；即说明在-10℃冻存条件下，FⅤ、FⅡ沉淀可以耐受该保存时间的冻存，符合预期要求，试验结果符合要求。经实验确认，FⅤ、FⅡ沉淀对较高冻存温度（-10℃）的最长耐受时间均大于为72h。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2015.

[2]国家食品药品监督管理局.药品生产质量管理规范（GMP）[EB/OL].(2015-01-19)[2016-07-15].http://www.doc88.com/ p-6631812004183.html.

[3]汪世华.蛋白质工程[M].北京:科学出版社,2008:29-30.

Effect of Protein in Precipitation from Human Plasma Protein with Different Frozen Storage Temperature and Time

Yang Yong1，2,Ding Hong-bo2,Tang Jian2,Wang Jian-mei1
(1.School of Life Science,Sichuan University,Sichuan Chengdu 610000; 2.Chengdu Rong Sheng Pharmaceutical Co. Ltd.,Sichuan Chengdu 610000)

Chinese Pharmacopoeia 2015 provides protein precipitation should be frozen at - 30℃,and the provisions of the period of validity; But the provisions only provide "final freezing temperature",or "cold storage equipment set temperature",did not set up about the precipitation of the frozen storage cooling process or time. Because there are differences in the refrigeration capacity of the low temperature storage bins or cold storage,although the set of frozen storage temperature is same,and the cooling time is long enough to reach and stabilize the temperature of the target. But in the actual production process,in the statistical process of freezing time and temperature of the precipitation,found that the actual cooling time of FⅤand FⅡprecipitation freezing process may be different,it may be more than 48 hours of cooling time range. In order to investigate this kind of situation,the experiment on the effect of the quality of the frozen precipitation was carried out. The results showed that the longest tolerance time of the FⅤand FⅡof high temperature frozen precipitation deposit (-10 ℃) were 72 hours.

Precipitation from human plasma protein; Frozen storage temperature; Frozen maximum tolerance time

R341

A

2096-0387（2016）05-0015-03

杨勇（1983-），四川成都人，硕士研究生，研究方向：生命科学。