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南京军区南京总医院消化内科1 (210002) 南方医科大学南京临床学院2
糖分子探针与炎症因子、Claudin-8在结肠炎大鼠肠黏膜通透性改变中的相关性*
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南京军区南京总医院消化内科1(210002) 南方医科大学南京临床学院2
背景:肠黏膜通透性改变是溃疡性结肠炎发展的重要环节。糖分子探针是检测通透性的一种安全无创的方法,其与炎症因子、claudin-8在黏膜通透性改变中的相关性尚不明确。目的:探讨糖分子探针与TNF-α、CRP和claudin-8在结肠炎大鼠肠黏膜通透性改变中的相关性。方法: 24只大鼠随机分为模型组和正常对照组,以DSS溶液制备结肠炎模型。ELISA法检测TNF-α、CRP表达,免疫组化法检测claudin-8表达,高效液相色谱仪检测糖分子探针含量,分析炎症因子、claudin-8与糖分子探针的相关性。结果:与正常对照组相比,模型组结肠组织TNF-α、CRP表达显著升高(P<0.01);claudin-8表达显著降低(P<0.01);乳果糖和三氯蔗糖排出量以及乳果糖/甘露醇比值明显升高(P<0.01),甘露醇排出量明显降低(P<0.01)。乳果糖、三氯蔗糖排出量与TNF-α、CRP表达呈正相关(P<0.01),与claudin-8表达呈负相关(P<0.01);而乳果糖/甘露醇比值、甘露醇排出量与TNF-α、CRP表达呈负相关(P<0.01),与claudin-8表达呈正相关(P<0.01)。结论:糖分子探针与TNF-α、CRP以及claudin-8表达在提示大鼠肠黏膜通透性改变上的结果一致。糖分子探针可作为一种反映肠黏膜通透性改变的潜在检测方法。
通透性; 分子探针; 肿瘤坏死因子α; C反应蛋白质; claudin-8; 结肠炎, 溃疡性
Colitis, Ulcerative
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种肠道慢性炎症性疾病,肠黏膜屏障功能损伤是UC发生、发展的重要环节。TNF-α在UC患者结肠组织和巨噬细胞表面均有表达,血清TNF-α水平与反映疾病活动度的临床和实验指标密切相关。CRP在炎症性肠病与肠道功能性疾病的鉴别诊断中起重要作用,UC患者血清CRP含量明显升高,与疾病严重程度相关,可作为检测UC病情进展的重要参数。Claudin是一种四次跨膜的结构蛋白,是细胞间隙通透性的重要调节因子。UC活动期结肠上皮细胞claudin-8亚型与上皮细胞间隙通透性有密切的关系。糖分子探针通过口服一定剂量的糖,检测糖在代谢过程中的消耗量来评估胃肠道吸收情况,从而间接反映胃肠黏膜受损情况,特定糖的吸收部位有所不同,故可根据糖的种类确定受损部位。目前糖分子探针与炎症因子、claudin-8在黏膜通透性改变中的相关性尚不明确。本实验采用高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography, HPLC)检测大鼠尿液中糖分子探针含量,旨在对其与炎症因子、claudin-8在UC肠黏膜通透性中的相关性作一分析。
一、实验动物和主要试剂
健康清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只,3月龄,体质量(200±20) g,由南京军区南京总医院比较医学科提供。大鼠饲养于标准实验鼠笼中,适应性喂养1周。
二、研究方法
1. 模型制备:SD大鼠随机分成正常对照组和模型组,每组各12只,正常对照组大鼠自由饮水进食,模型组大鼠自由饮用DSS溶液7 d,建立结肠炎模型。每日测定大鼠体质量,粪便隐血试验阳性甚至出现肉眼血便,表示造模成功。
2. 取材和标本处理:造模成功后,采取灌胃法分别口服2 mL 0.06 g/mL乳果糖、0.04 g/mL甘露醇、0.03 g/mL三氯蔗糖。10%的麝香草酚加入异丙醇配制成100 mL溶液,以阻止细菌降解尿糖。大鼠禁水3 h。收集24 h尿液。麻醉后处死大鼠,取结肠远端长约0.5 cm的组织,置于4%甲醛溶液中固定,用于HE染色和免疫组化染色。其余结肠组织-20 ℃保存,用于检测TNF-α和CRP水平。
3. ELISA法检测结肠组织TNF-α、CRP水平:将结肠组织配制成匀浆液后离心,经稀释、加样、洗涤、孵育后测定波长为450 nm处的A值。BCA法定量,用上清液蛋白含量对样品中炎症因子含量进行再校正。
4. 免疫组化法检测claudin-8表达:取各组大鼠结肠组织切片,按试剂盒说明书行免疫组化二步法(一抗和二抗的工作浓度分别为 1∶100 和 1∶10)。
结果判断:细胞膜和细胞间隙呈棕黄色为claudin-8阳性表达。用Image-Pro Plus图像分析软件进行图像分析,随机计数4个视野,高倍镜下计数阳性细胞,参照王娟等[1]的研究方法,半定量计算claudin-8阳性表达。
5. HPLC法:尿样、标准样置于氮气环境中,75 ℃温箱干燥。冷却后每管加100 μL肟化液,75 ℃温箱放置30 min。冷却后每管加100 μL N-3甲基硅烷咪唑,75 ℃温箱放置15 min,冷却。采用HPLC检测尿液中乳果糖、甘露醇、三氯蔗糖含量,计算乳果糖/甘露醇(L/M)比值,具体步骤按说明书操作。
三、统计学分析
其中,HU(Hounsfield Unit)为三维空间中每个单元对于二维图像的CT值,ρash为灰度密度值,E为相应位置单元材料的弹性模量,单位为MPa。通过Mimics材料赋值模块,完成骨骼网格模型的非均匀单元赋值。
一、HE染色
正常对照组黏膜上皮完整,细胞形态正常,杯状细胞可见,腺体排列整齐,黏膜下层、肌层、浆膜层结构清晰。模型组黏膜上皮坏死脱落,上皮内杯状细胞减少,隐窝破坏;炎症渗出,典型溃疡形成,大量炎性细胞浸润,以中性粒细胞为主,可见出血性坏死(图1)。表明成功制备结肠炎模型。
A:正常对照组;B:模型组
二、炎症因子水平
与正常对照组相比,模型组结肠组织TNF-α[(8.51±1.55) pg/mg对(2.21±0.38) pg/mg,P<0.01]、CRP[(161.80±35.60) ng/mg对(50.50±5.90) ng/mg,P<0.01]表达均显著升高。
三、免疫组化染色
模型组claudin-8阳性表达主要定位于上皮细胞和血管内皮细胞的细胞膜和细胞间隙,正常对照组claudin-8表达较低,可见上皮细胞和血管内皮细胞少量表达(图2);模型组claudin-8表达较正常对照组显著降低(0.100±0.007对0.200±0.011,P<0.01)。
A:正常对照组;B:模型组
四、分子探针含量
与正常对照组相比,模型组乳果糖排出量、三氯蔗糖排出量明显升高(P<0.01),L/M比值明显升高(17.55±5.02对0.80±0.69,P<0.01),甘露醇排出量显著降低(P<0.01)(图3)。
五、相关性分析
乳果糖、三氯蔗糖排出量与TNF-α、CRP表达呈正相关(P<0.01),与claudin-8表达呈负相关(P<0.01);L/M 比值、甘露醇排出量与TNF-α、CRP表达呈负相关(P<0.01),与claudin-8表达呈正相关(P<0.01)。
图3 两组大鼠糖分子探针排出量比较(HPLC法)
目前研究认为UC的发病机制可能与环境、遗传、免疫等因素共同作用所致的肠黏膜屏障功能损伤有关[2]。肠黏膜通透性改变可能是发病的基础。
肠黏膜局部炎症反应是UC发生、发展的主要病理机制,与一系列细胞因子的级联瀑布效应有关。TNF-α是一种前炎症因子,主要由巨噬细胞、单核细胞和分化的T细胞分泌,可刺激免疫细胞分泌IL-1β和IL-6,上调黏附分子和促凝血因子的表达,引发细胞毒性急性反应[3]。Olsen等[4]发现,组织TNF-α水平与局部炎症反应的分级呈正相关。有研究[5]发现claudin-8在结肠炎模型大鼠结肠组织中的表达降低,导致紧密连接中断,提示claudin-8可能与UC的发生、发展有一定关联。有研究认为,UC患者的CRP与临床表现、内镜下表现以及组织学表现有较好的相关性[6-7];CRP亦可提示UC患者内镜下肠道表现[8]。
糖分子探针可对尿液中的糖进行检测,无需取血,是目前公认的检测胃肠黏膜损伤的无创性方法[9]。目前有三类糖分子探针:第一类糖探针在离开胃时就已完全被破坏,如蔗糖,用于检测上胃肠道黏膜通透性;第二类糖探针在离开小肠时就已完全被破坏,如乳果糖、甘露醇,用于检测小肠黏膜通透性;第三类糖探针全程均不降解,如三氯蔗糖,用于检测全消化道黏膜通透性[10]。乳果糖和甘露醇在肠道内的吸收途径不同[11],乳果糖分子质量为342 kDa (1 Da=0.992 1 u),通过小肠黏膜上皮细胞间的静脉连接吸收;甘露醇分子质量为182 kDa,通过小肠上皮细胞膜的水溶性微孔吸收。进入血液循环后两者均不易代谢,最终从尿液中排出,因此可通过定量尿液中两者的含量,反应其吸收量。尿液中L/M比值升高,表明上皮细胞间的结构发生改变,如肠黏膜紧密连接破坏,区域性肠上皮细胞缺失或绒毛末梢损伤,并因此造成黏膜通透性增加,组织间隙水肿。故测定尿液中L/M比值可较为准确地反映肠黏膜通透性的改变[12]。
结合多种检测方法可较为准确地反映肠黏膜的改变。目前临床上主要通过结肠镜观察黏膜的溃疡性改变,并通过取活检观察黏膜超微结构的改变来了解肠道损伤情况,有时还需进一步采取免疫组化检测炎症因子来了解肠黏膜损伤情况,但这些检测耗时且费用不低。而糖分子探针是一种更为简单易行、创伤小、费用低、安全可靠的检测方法。本研究首先成功构建了结肠炎大鼠模型,再分别利用结肠组织TNF-α、CRP、claudin-8表达以及糖分子探针检测大鼠肠道通透性的改变。结果显示模型组大鼠表现为典型的结肠炎改变,黏膜上皮坏死脱落,炎症渗出,典型溃疡形成,大量炎性细胞浸润,可见出血性坏死。L/M比值和三氯蔗糖排出量明显改变,提示结肠炎时肠黏膜通透性发生改变。且模型组TNF-α、CRP表达均明显高于正常对照组,说明结肠炎时肠道发生炎症性改变,与文献报道一致[4-5,13];紧密连接蛋白claudin-8表达明显降低,提示肠黏膜通透性发生改变。上述结果与糖分子探针一致,共同反映了肠黏膜的炎症损害。相关性分析显示乳果糖、三氯蔗糖排出量与TNF-α、CRP表达呈正相关,与claudin-8表达呈负相关;而L/M比值、甘露醇排出量与TNF-α、CRP表达呈负相关,与claudin-8表达呈正相关。
综上所述,糖分子探针与TNF-α、CRP、claudin-8表达在提示大鼠肠黏膜通透性改变上具有一致性。有望作为临床上检测肠黏膜通透性的无创方法,具有较好的临床使用前景。
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(2016-03-08收稿;2016-04-03修回)
Correlation of Sugar Molecular Probes with Inflammatory Factors and Claudin-8 in Intestinal Permeability in Colitis Rats
SHIHui1,2,WANGZhenkai1,WANGShaodong1,LUYouke1,WANGFangyu1.
1DepartmentofGastroenterologyandHepatology,JinlingHospitalofNanjingMilitaryCommandofPLA,Nanjing(210002);2SouthernMedicalUniversity,SchoolofMedicine,Guangzhou
WANG Fangyu, Email: wangfy65@nju.edu.cn
Permeability; Molecular Probes; Tumor Necrosis Factor-alpha; C-Reactive Protein; Claudin-8;
10.3969/j.issn.1008-7125.2016.10.006
南京军区南京总医院青年课题基金(批准号:2008021)、中国博士后科学基金面上资助(201150M1575)、中国博士后科学基金特别资助(2012T50895)
#Email: 32767572@qq.com
▲本文通信作者, Email: wangfy65@nju.edu.cn
Background: Intestinal permeability plays an important role in the development of ulcerative colitis. Sugar molecular probes is a safe and non-invasive method to measure intestinal permeability, and its correlation with inflammatory factors and claudin-8 is not clear. Aims: To explore the correlation of sugar molecular probes with TNF-α, CRP and claudin-8 in intestinal permeability in colitis rats. Methods: Twenty-four rats were assigned randomly to model group and normal control group. Colitis model was induced by DSS solution. Expressions of TNF-α, CRP were determined by ELISA, and expression of claudin-8 was determined by immunohistochemistry. Sugar molecular probes were determined by high performance liquid chromatography. Correlations of inflammatory factors and claudin-8 with sugar molecular probes were analyzed. Results: Compared with normal control group, expressions of colonic tissue TNF-α and CRP were significantly increased while expression of claudin-8 was significantly decreased in model group (P<0.01); secretion of lactulose and sucrolose, ratio of lactulose/mannitol (L/M) were significantly increased (P<0.01) while mannitol secretion was significantly decreased (P<0.01). Secretion of lactulose and sucrolose were positively correlated with expressions of TNF-α and CRP (P<0.01), but negatively with expression of claudin-8 (P<0.01). L/M ratio and mannitol secretion were negatively correlated with expressions of TNF-α and CRP (P<0.01), but positively with expression of claudin-8 (P<0.01). Conclusions: Sugar molecular probes and expressions of TNF-α, CRP, claudin-8 have similar results in predicting intestinal permeability in rats. Sugar molecular probes can be used as a potential method to measure intestinal permeability.