发酵牛肉火腿中ACE抑制肽的稳定性研究

韩冬雪，李晶晶，张瑞红，俞龙浩

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319）

发酵牛肉火腿中ACE抑制肽的稳定性研究

韩冬雪，李晶晶，张瑞红，俞龙浩

（黑龙江八一农垦大学食品学院，大庆163319）

研究了发酵牛肉火腿中提取的ACE抑制肽的热处理、室温储存和模拟胃肠道消化稳定性。结果表明，发酵牛肉火腿中提取的ACE抑制肽，在50、72、85和100℃下处理5 min和100℃下5、10、20和40 min处理后，处理组和对照组ACE抑制活性无显著差异。在室温下储存2 d，处理组和对照组ACE抑制活性无显著差异（P＞0.05），但储存至3 d，它的ACE抑制活性显著低于对照组（P＜0.05），其后储藏时间对提取物的ACE抑制活性无显著影响。ACE抑制肽经体外模拟胃肠道消化后，其活性与对照组无显著差异。

发酵牛肉火腿；ACE抑制肽；常温储存；热处理；胃肠消化

许多膳食蛋白质在消化、发酵或加工熟化时都会释放出多肽，其中有些多肽对生物机体的生命活动有益或具有生理作用，能够改善人体健康，因此被称为生物活性肽［1］。生物活性肽能够发挥不同的生物活性，如抗氧化，抗血栓形成，抗高血压，免疫调节，和类鸦片等作用。因此，多肽特殊的生物学性能使它们很可能成为功能性成分，改善人体健康［2］。

ACE能够引起高血压，它是一种二肽酰羧肽酶，它能促进血管紧张肽Ⅰ转化为血管紧张肽Ⅱ，血管紧张肽Ⅱ是一种能够引起高血压，使抗高血压肽失去活性的物质，这种抗高血压肽为血管舒缓激肽。近年来，ACE抑制剂因其能够抑制高血压而受到广泛关注。ACE抑制剂包括ACE抑制肽和抑制ACE的药物等。前人的研究指出ACE抑制肽来源于肌浆球蛋白、肌动蛋白和一些水溶性蛋白［3-4］。Katayama等［5］研究指出，ACE抑制肽不尽能由前面所述的蛋白质产生，也可由调节蛋白质产生，如原肌球蛋白和肌钙蛋白。目前国外已经有关于西班牙干腌火腿［6］、牛肉肌浆蛋白水解产物［7］、金枪鱼结构蛋白酶解产物［8］和鸡肉胶原蛋白水解产物等［9］肉源ACE抑制肽的研究报告。国内对于植物源ACE抑制肽的研究较多，如大孔吸附树脂吸附米糠蛋白得到的ACE抑制肽［10］和花生ACE抑制肽等［11］。另外还有关于乳源ACE抑制肽的研究，如α-S2-牛乳酪蛋白经酶解产生的ACE抑制肽［12］和发酵乳中分离出的ACE抑制肽等［13］。但国内关于肉类深加工产品中ACE抑制肽的研究很少。我们的前期研究表明，较常见的市售中国传统火腿制品，如金华火腿、如皋火腿、安福火腿和宣威火腿，它们在加工过程中会发生蛋白质水解，但是从这些火腿中提取的小肽并没有显示出ACE抑制活性，而从实验室开发的发酵牛肉火腿提取的多肽，显示出了ACE抑制活性，然而我们还不了解它在加工和食用后是否仍具有ACE抑制活性。

因此，对发酵牛肉火腿中多肽提取物的热处理、室温储藏和体外模拟胃肠道消化稳定性进行了研究，来确定实验室开发的发酵牛肉火腿中ACE抑制肽的稳定性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

马尿酰组胺酰亮氨酸（HHL）和血管紧张素转换酶（ACE）都购买于德国Sigma公司；HCl、乙醇、乙酸乙酯均为分析纯；牛肉发酵火腿由实验室制作提供。

1.2 实验仪器

离心机CR21G（Hitachi，Japan）；旋转蒸发气；无菌均质机Scientz-04（宁波新芝科技）；紫外分光光度计Specord210 Plus（analytikjena，Germany），电热恒温水浴锅DK-S24型（上海森信实验仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱DGG-9030A型（上海森信实验仪器有限公司），pH计S40（METTLER TOLEDO，USA）。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵牛肉火腿中多肽的提取

根据Elizabeth Escudero等［6］在发酵火腿中多肽提取方法，取发酵牛肉火腿20 g，放入均质袋中，加50 mL 0.01N的HCl均质9 min，移入离心管中在4℃、3 000 r·min-1离心20 min，纱布过滤，滤去残渣取上清液，加3倍体积乙醇在4℃静置20 min，然后4℃、12 000 r·min-1离心20 min取上清液，用0.45 μm尼龙膜过滤器过滤，用旋转蒸发器蒸发至干燥，加10 mL 0.01N HCl重溶，在-20℃储存待用。

1.3.2 体外ACE抑制活性的测定

根据Yamamoto等［14］的马尿酸方法对样品的ACE抑制活性进行测定。在10 mL试管中加入200 μL的HHL和80 μL样品，在37℃保温3 min，随后加入20 μL的ACE溶液，漩涡混合均匀后，在37℃保温30 min。加250 μL的1.0 1 mol·L-1HCl溶液终止反应。再加1.7 mL乙酸乙酯，振荡20 s后静置5 min。吸取1.0 mL乙酸乙酯层，120℃烘箱烘干。加入3.0 mL蒸馏水，混匀后在波长228 nm处测定吸光度值。

ACE抑制率计算公式如下：

式中：A：含样品和ACE的吸光度值；

B：不含样品，含ACE的吸光度值；

C：不含样品和ACE的吸光度值。

1.3.3 发酵牛肉火腿ACE抑制肽热处理稳定性测定

为了测定不同温度相同时间处理对发酵火腿中ACE抑制肽稳定性的影响，取发酵牛肉火腿多肽提取液在50、72、85和100℃温度下分别处理5 min，然后冷却至常温后与原提取液作为对照组进行活性比较。

为了相同温度不同时间处理对发酵火腿中ACE抑制肽稳定性的影响，取发酵牛肉火腿多肽提取液，在100℃，分别处理0、5、10、20和40 min，然后冷却至常温后与原提取液作为对照组进行活性比较。

1.3.4 发酵牛肉火腿ACE抑制肽常温储存稳定性测定

发酵牛肉火腿ACE抑制肽溶液，在常温下分别存放1、2、3、4 d，然后按照上述方法，对其ACE抑制活性进行测定。ACE抑制活性测定方法同1.3.2的体外ACE抑制活性测定方法一致。

1.3.5 发酵牛肉火腿ACE抑制肽的消化稳定性测定

发酵牛肉火腿ACE抑制肽的体外消化稳定性测定，根据Laparra等［15］的方法稍作修改进行，即用胃蛋白酶和胰蛋白酶模拟胃肠道消化，将胃蛋白酶溶解在6 M HCl（pH 2.0）中，之后添加到发酵牛肉火腿提取物中，胃蛋白酶和提取物的比例为1∶100。在37℃消化2 h后用1M NaHCO3将pH调节至7.2使酶灭活。随后添加胰蛋白酶，胰蛋白酶和提取物的比例为1∶50。在37℃消化3 h后加热至95℃保持10 min使酶灭活。将其冻干后，用去离子水使其溶解后测定ACE抑制活性。

1.4 数据处理

利用SAS软件（Institute 2000）对测定的数据进行差异性分析，确定测得数据的平均值、标准差和变量。采用Duncan多重检验确定各平均值间的显著差异（P＜0.05）。实验中对每个样品均做了三重复测定。

2 结果与讨论

2.1 温度和时间对发酵牛肉火腿ACE抑制肽活性的影响

实验中对提取物ACE抑制肽处理50、72、85和100℃加热5 min结果，其活性分别为56.53、48.53、54.89、52.03%，与对照组活性58.95%比较没有显著差异（Fig.1）。这一结果提示，在不同温度下较短时间处理对发酵牛肉火腿ACE抑制肽活性没有影响。Hwang［16］研究发现，在不同温度下烹调的金枪鱼汁中的ACE抑制肽都有很好的稳定性，且在处理前后成分几乎相同。Tidarat［17］研究指出，罗非鱼肉泥用杆菌属的SK1-3-7蛋白酶水解后显示出ACE抑制活性，且其水解产物在100和121℃都显示出很好的热稳定性。杨锋［18］的研究表明醋蛋中ACE抑制肽在5、30、50、70℃下保温60 min后，它的抑制活性仍较稳定。

对发酵牛肉火腿ACE抑制肽提取物100℃加热5、10、20、40 min处理结果，其活性分别为81.38%、76.69%、82.41%、80.98%，与对照组活性85.58%比较也没有显示显著差异（图2）。这一结果提示，在100℃不同时间处理对发酵牛肉火腿ACE抑制肽活性也没有影响。Wu和Ding报告［19］，来源于大豆蛋白的ACE抑制肽在20、40、60、80和100℃保温2 h后，这五个处理组间的ACE抑制活性无显著差异。于志鹏［25］的研究指出，蛋清蛋白经碱性蛋白酶Alcalase酶解后，获得的血管紧张素转化酶抑制肽具有耐热性。

由此得出，发酵牛肉火腿ACE抑制肽对不同温度和时间处理具有较好的稳定性，至少对100℃处理40 min时还表现出较好的热稳定性。

2.2 室温储存对发酵牛肉火腿ACE抑制肽活性的影响

对发酵牛肉火腿ACE抑制肽分离提纯时发现，发酵牛肉火腿ACE抑制肽如果长时间暴露在室温下会对其ACE抑制活性产生影响。但是到目前为止还未见到较长的室温储存时间对ACE抑制肽活性影响的报告。因此我们对发酵火腿中ACE抑制肽的室温储存稳定性进行了研究。

发酵牛肉火腿ACE抑制肽提取物室温下处理1、2、3和4 d结果，其活性分别为62.73%、62.58%、44.63%、44.44%。在储存1和2 d时，与对照组活性63.25%比较没有显著差异（图3），当储存至3和4 d时，与对照组活性比较下降了约30%。这一结果提示，在室温下储存2 d时，对发酵牛肉火腿ACE抑制肽活性没有影响，而储存至3 d时，对发酵牛肉火腿ACE抑制肽活性影响显著，此后储藏时间对提取物的ACE抑制活性无显著影响。

图1 不同温度处理5 min对发酵牛肉火腿中ACE抑制肽活性的影响Fig.1Effects of ACE inhibitory peptides activity of fermented beef ham at different temperature treatment for 5 min

图2100 ℃处理不同时间对发酵牛肉火腿中ACE抑制肽活性的影响Fig.2Effects of ACE inhibitory peptides activity of fermented beef ham at 100℃treatment for different times

图3 室温储存不同天数对发酵牛肉火腿中ACE抑制肽活性的影响Fig.3Effects of ACE inhibitory peptides activity of fermented beef ham at room temperature store for different days

2.3 体外消化对发酵火腿中多肽的ACE抑制活性的影响

蛋白酶在消化过程中会产生生物活性肽，但是这些活性肽存在于母源蛋白中时是没有活性的。如果ACE抑制肽以活化型进入血液，便能够在体内发挥抗高血压作用。所以，多肽在口服后要能够抵抗胃肠酶和刷状缘肽酶的水解作用并穿过小肠壁，才能够保留它们的生物活性。在此过程中，多肽会被分解，这可能会激发它们的生物活性，或者使它们的生物活性消失。

实验中经胃蛋白酶消化处理的样品ACE抑制活性仍然具有较高的活性与未经处理组无显著性差异（表1）。这表明发酵牛肉火腿提取物中存在的多肽，能够抵抗胃肠的消化，或者它们中的一部分会被分解为更小的多肽，而且能够保持抗高血压生物活性。前人的研究指出，小肽经消化后仍有ACE抑制活性［15］。贾俊强等［20］研究发现，蚕蛹源ACE抑制肽经肠道酶消化后，部分ACE抑制肽会被分解成失活片段，或生成新的ACE抑制肽，最终使得蚕蛹源ACE抑制肽经过体外消化后仍具有ACE抑制活性。这些结果表明，ACE抑制肽经口服后，在胃部能保持它们完整的序列，或断裂成更小具有ACE抑制活性的生物活性肽。

表1 体外模拟胃肠消化对发酵牛肉火腿中ACE抑制肽活性的影响Table 1Effects of ACE inhibitory peptides activity of fermented beef ham in vitro digestion by gastrointestinal proteases

3 结论

实验室开发的发酵牛肉火腿中提取的多肽溶液在不同温度下处理5 min和100℃处理不同时间后，其ACE抑制活性与对照组相比均无显著差异。并且在室温下储存至2 d，其ACE抑制活性与对照组相比无显著差异，但是储存到3 d时，其ACE抑制活性与对照组相比显著降低（P＜0.05），此后其ACE抑制活性趋于稳定，储存至4 d时的ACE抑制活性与对照组相比大约下降了30%。因此，对此类提取物进行分离和纯化时，要注意控制温度和时间，避免提取物长时间暴露在室温下，以免影响其后的功能及结构等分析测定。

［1］Korhonen H，Pihlanto-Leppala A，Rantamaki P，et al.Impact of processing on bioactive proteins and peptides［J］.Trends in Food Science&Technology，1998（8-9）：307-319.

［2］于婷，李雪，韩春姬，等.发酵技术改善中药降血糖作用的研究进展［J］.延边大学农学学报，2015，37（1）：80.

［3］Arihara K，Nakashima Y，Mukai T，et al.Peptide inhibitors for angiotensin I-converting enzyme from enzymatic hydrolysates of porcine skeletal muscle proteins［J］.Meat Science，2001，57（3）：319-324.

［4］乔潇，郎秀峰.功能化多肽的研究概述［J］.河北科技师范学院学报，2015，29（1）：70.

［5］Katayama K，Fuchu H，Sakata A，et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activities of porcine skeletal muscle proteins following enzyme digestion［J］.Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2003，16（3）：417-424.

［6］Elizabeth E，Maria-Concepcion A，Hitoshi N，et al.Antihypertensive effect and antioxidant activity of peptide fractions extracted from Spanish dry-cured ham［J］.Meat Science，2012，91（3）：306-311.

［7］Jang A，Lee M.Purification and identification of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides from beef hydrolysates［J］.Meat Science，2005，69（4）：653-661.

［8］Lee S H，Qian Z J，Kim S K.A novel angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide from tuna frame protein hydrolysate and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats［J］.Food Chemistry，2010，118（1）：96-102.

［9］Iwai K，Zhang Y，Kouguchi T，et al.Blood concentration of food-derived peptides following oral intake of chicken collagen hydrolysate and its angiotensin-converting enzyme inhibitory activity in healthy volunteers［J］.Nippon Shokuhin，2009，56（6）：326-330.

［10］张焱，翟爱华.大孔树脂吸附分离米糠中ACE抑制肽工艺［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2013，25（5）：41-47.

［11］江利华，王璋，许时婴，等.花生ACE抑制肽的分离纯化、结构鉴定及体内降血压功能研究［J］.食品工业科技，2009，30（10）：94-100.［12］Tauzin J，Miclo L，Gaillard J L.Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides from tryptic hydrolysate of bovine α-S2-casein［J］.FEBS Letters，2002，531（2）：369-374.

［13］吴琼英，马海乐.发酵乳中血管紧张素转换酶抑制剂的分离与鉴定［J］.食品科学，2006，27（7）：81-85.

［14］Yamamoto S，Toida I，Iwai K.Re-examination of spectrophotometric assay for serum Angiotensin 1converting enzyme［J］.Nihon Kyobu Shikkann Gakkai Zasshi（in Japanese），1980，18：297-302.

［15］Laparra J M，Vélez D，Montoro R，et al.Estimation of arsenic bioaccessibility in edible seaweed by an in vitro digestion method［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2003，51（20）：6080-6085.

［16］Hwang J S.Impact of processing on stability of angiotensin I-converting enzyme（ACE）inhibitory peptides obtained from tuna cooking juice［J］.Food Research International，2010，43（3）：902-906.

［17］Tidarat T，Sittiruk R，Jirawat Y.Characterization and identification of angiotensin I-converting enzyme（ACE）inhibitorypeptidesderivedfromtilapiausing Virgibacillus halodenitrificans SK1-3-7 proteinases［J］. Journal of Functional Foods，2015，14：435-444.

［18］杨锋，马千里，黄永春.醋蛋中ACE抑制肽的分离及稳定性研究［J］.食品科学，2009，30（24）：77-79.

［19］Wu J，Ding X.Characterization of inhibition and stability of soy-proteinderived angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides［J］.Food Research International，2002，35（4）：367-375.

［20］贾俊强，吴琼英，徐金玲，等.蚕蛹源ACE抑制肽的稳定性和抑制ACE动力学［J］.食品与生物技术学报，2012，32（8）：875-881.

Stability of ACE Inhibitory Peptides in Fermented Beef Ham

Han Dongxue，Li Jingjing，Zhang Ruihong，Yu Longhao
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The study aimed to investigate the stability of ACE inhibitory peptides in fermented beef ham after heat treatment，room temperature storage and simulated gastrointestinal digestion.The results indicated that ACE inhibitory activity of treatment and control groups had no significant difference when ACE inhibitory peptides in fermented beef ham was incubated at 50，72，85 and 100℃for 5 min and 100℃for 5，10，20 and 40 min.Stored at room temperature for 2 days，ACE inhibitory activity of treatment and control groups had no significant difference（P＞0.05），but ACE inhibitory activity of the treatment group was significant inferior to the control group（P＜0.05）in 3 day，then there was no significant influence on ACE inhibitory activity for further storage.ACE inhibitory activity of the peptides was treated by simulated gastrointestinal digestion that compared with the control group，which had no significant difference.

fermented beef ham；ACE inhibitory peptides；room temperature storage；heat treatment；gastrointestinal digestion

S351.1

A

1002-2090（2016）04-0041-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.04.010

2015-05-15

黑龙江省科技厅资助项目（WB09B201-2）。

韩冬雪（1987-），女，黑龙江八一农垦大学食品学院2012级硕士研究生。

俞龙浩，男，教授，硕士研究生导师，E-mail：yu2058@sohu.com。