福建省耐多药结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物表型耐药与gyrA基因突变特征分析

魏淑贞，赵 永，梁庆福，林 建，林淑芳



福建省耐多药结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物表型耐药与gyrA基因突变特征分析

魏淑贞1，赵 永1，梁庆福1，林 建1，林淑芳1

目的 了解福建省耐多药(Multi-drug resistant, MDR)结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones，FQs)的gyrA基因突变特征，为FQs耐药菌株的快速分子药敏检测提供基础科学数据。方法 收集来自福建省2010-2011年和2008-2009年耐药监测点的所有MDR Mtb临床菌株，采用常规比例法进行FQs敏感性试验。PCR扩增包含gyrA耐药决定区的基因片段，测序后比对分析。结果 共收集到MDR结核分枝杆菌临床菌株119株，经常规药敏试验，氧氟沙星(Ofloxacin,Ofx)的耐药率为26.89%,左氧氟沙星(Levofloxacin,Lfx)耐药率为25.21%，莫西沙星(Moxifloxacin,Mfx)耐药率为11.76%。FQs敏感株gyrA基因未检测到突变。gyrA基因在Ofx耐药菌株的突变率为84.38%(27/32)，Lfx耐药菌株的突变率为83.33%(25/30), Mfx耐药菌株的突变率为92.86%(13/14)。gyrA基因突变为点突变，共发现有5种突变类型，以Asp94Gly，Asp94Asn和Ala90Val为主。结论 福建省MDR-Mtb对FQs耐药的主要原因是gyrA基因突变，最常见的突变位于第94位，第90位和第91位密码子。

结核分枝杆菌；耐多药；氟喹诺酮类药物；基因突变

结核病(tuberculosis, TB)是严重威胁全球公共卫生的传染性疾病。耐药结核病，尤其是耐多药(multidrug resistant TB，MDR-TB)和广泛耐药(extensively drug resistant TB， XDR-TB)的出现及传播增加了结核病控制和治疗的难度。氟喹诺酮类药物(Fluoroquinolones，FQs)是目前用于治疗耐药和MDR-TB及XDR-TB的核心二线抗结核药物，包括氧氟沙星(Ofloxacin，Ofx)，左氧氟沙星(Levofloxacin，Lfx)，莫西沙星(Moxifloxacin，Mfx)等药物，同时该类药物也用于对一线抗结核药物不能耐受者的治疗。然而，FQs被广泛用于呼吸道、胃肠道及泌尿系统感染等的治疗，以及FQs的不规范使用导致结核病对FQs的耐药水平增加。据2007-2008年全国结核病耐药性基线调查报告显示：MDR-TB患者中Ofx的耐药率为27.43%[1]。对MDR-TB进行FQs耐药的研究受到关注。

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)DNA旋转酶是FQs作用于Mtb的唯一靶标，FQs通过抑制DNA旋转酶的活性，阻止该酶拓扑异构变化，干扰细菌复制、修复和重组，导致细菌死亡。Mtb旋转酶由2个A和2个B亚单位组成，分别由gyrA和gyrB两个基因编码。对于临床Mtb菌株，gyrB基因较少发生突变，gyrA基因突变是Mtb对FQs耐药的最主要原因,并且突变位点主要集中于gyrA基因的FQs耐药决定区(QRDR)[2]。然而，gyrA基因突变的频率和突变类型具有地区差异。为了掌握福建省MDR-Mtb对FQs的表型耐药及耐药基因gyrA的突变特征，我们对来自福建省耐药监测点的119株MDR-Mtb临床分离株进行研究。

1 材料与方法

1.1 菌株 119株MDR-Mtb临床菌株中，79株分离自2010-2011年福建省30个耐药监测点，另40株分离自2008-2009年福建省9个耐药监测点。标准菌株H37Rv由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。

1.2 菌种鉴定和药物敏感性试验 收集来的菌株经改良罗氏(L-J)培养基培养2～3周，用含对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基及对照培养基鉴别结核分枝杆菌、牛结核杆菌和非结核分枝杆菌。采用WHO推荐的比例法[3]进行敏感性试验，各药物临界浓度分别为：INH 0.2 μg/mL, RFP 40 μg/mL, SM 4 μg/mL, EMB 2 μg/mL，Ofx 2 μg/mL, Lfx 2 μg/mL和Mfx 0.25 μg/mL。

1.3 制备DNA 从L-J培基中生长良好的Mtb取一菌环，溶于200 μL TE(pH=8.0)中，经旋涡振荡器上振荡均匀后，放在95℃水浴锅中15 min后，3 000 r/min离心5 min，取上清。

1.4 基因扩增及检测 采用上游引物：5′-GGGTGCTCTATGCAATGTTCG-3′，下游引物为5′-GCCGTCGTAGTTAGGGATGA-3′，扩增含gyrA基因耐药决定区(第74-103个密码子)的DNA片段长度为314 bp。PCR反应体系为50 μL， 包括2ⅹTaq PCR Master Mix 25 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL，模板5 μL，去离子水18 μL。PCR 扩增条件:94 ℃变性8 min ;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s,30个循环;再72 ℃延伸5 min。同时用H37Rv的DNA作为阳性对照，用去离子水作为阴性对照。PCR产物送北京擎科生物技术有限公司进行测序。

1.5 测序结果比对分析 测序序列以纯文本形式查询序列输http://www.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST查询框，与标准菌株H37Rv 的gyrA基因序列进行比对。同时排除测序引起的误差判断测序结果。

1.6 数据处理与分析 菌株背景及测序结果用统计软件SPSS 13.0分析相关数据，经χ2检验，P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 FQs耐药情况 经传统药敏检测，119株有32株对Ofx耐药， Ofx耐药率为26.89%，30株耐Lfx，Lfx耐药率为25.21%，14株耐Mfx(11.76%)，13株耐KM(10.9%),如表1所示。标准菌株H37Rv的药敏结果均为敏感。

表1 119株MDR结核分枝杆菌临床菌株FQs的耐药情况
Tab.1 Susceptibility of FQs about119 MDR-Mtb strains

ResistanttoNo.ofstrainsResistantrate(%)AnyofFQs Ofx3226.89 Lfx3025.21 Mfx1411.76 KM1310.9CrossresistanttoFQs Ofx+Lfx+Mfx1411.76 Ofx+Lfx1613.44 Ofx21.68

2.2 MDR-Mtb基因突变情况 119株MDR-Mtb测序结果经BLAST比对，118株菌株均发现gyrA基因第95位AGC→ACC突变。32株Ofx耐药菌株中有27株gyrA基因第90位，第91位和第94位密码子的突变，突变率为84.38%(27/32)。87株Ofx敏感株未发现其他位点突变。质控菌株H37Rv的gyrA基因无发生突变。

2.3 MDR-Mtb菌株gyrA基因耐药决定区突变特征 32株Ofx 耐药菌株有27株gyrA基因发生突变，突变率84.38%(27/32)，14株第94位密码子发生突变，其中6株发生94Asp→Gly突变，5株发生94Asp→Asn突变，3株发生94Asp→Ala突变；有9株第90位发生GCG→GTG(Ala→Val)突变；4株第91位发生TCG→CCG(Ser→Pro)突变。30株Lfx耐药菌株有13株第94位突变，其中6株发生94Asp→Gly突变，5株发生94Asp→Asn突变，2株发生94Asp→Ala突变；有8株90Ala→Val突变；有4株91Ser→Pro突变。14株Mfx耐药菌株有11株第94位发生突变，其中5株94Asp→Asn突变，5株94Asp→Gly突变，1株94Asp→Ala突变； 90Ala→Val突变和91Ser→Pro突变各1株。详见表2。

表2 MDR结核分枝杆菌FQs耐药相关的gyrA基因突变特征
Tab.2 Characteristics of gyrA mutation associated with resistant to FQs in MDR-Mtb strains

OfxLfxMfxSpecificmutationAcidaminochangeNo.ofstrainsMutationrate(%)RRR90GCG→GTG90Ala→Val13.70RRR91TCG→CCG91Ser→Pro13.70RRR94GAC→AAC94Asp→Asn518.52RRR94GAC→GCC94Asp→Ala13.70RRR94GAC→GGC94Asp→Gly518.52RRS90GCG→GTG90Ala→Val725.93RRS91TCG→CCG91Ser→Pro311.11RRS94GAC→GCC94Asp→Ala13.70RRS94GAC→GGC94Asp→Gly13.70RSS90GCG→GTG90Ala→Val13.70RSS94GAC→GCC94Asp→Ala13.70

3 讨 论

FQs与其他抗结核药物联合应用于治疗结核病，特别是耐药结核病具有良好的治疗效果。同时该类药物被临床广泛用于各类感染治疗，加上滥用现象，对FQs耐药问题越来越严重。本研究中119株MDR-Mtb有32株对FQs耐药，耐药率为26.89%，略低于全国耐药基线调查报告的27.43%[1]，远低于国内学者报道的40%[4]，这可能与菌株来源有关，同时也说明了MDR-Mtb对FQs耐药具有一定的地区差异。本研究Mfx耐药的菌株对Ofx和Lfx 均产生耐药；30株Lfx耐药的菌株全部对Ofx耐药，有16株对Mfx敏感(53.33%)，进一步说明Ofx，Lfx和Mfx之间为不完全交叉耐药，对于Ofx耐药患者，WHO 推荐Lfx或Mfx用于Ofx耐药患者的治疗[5]。本研究119株MDR菌株有41株为pre-XDR(占34.45%)，感染pre-XDR的患者发展成为XDR-TB的危险性极高，所以尽早发现pre-XDR患者并进行有效治疗格外关键。有效治疗MDR-TB患者最好进行药敏试验，而传统药敏试验耗时长，所需环境条件高，因此建立准确检测FQs等二线抗结核药物耐药的快速分子药敏势在必行。

gyrA基因是DNA旋转酶A亚基的编码基因，该基因突变导致FQs无法与DNA旋转酶A亚基结合，使MTB对FQs产生耐药[2]。32株FQs耐药的MDR菌株在gyrA基因均有第95位AGC→ACC 突变，同时有27株FQs耐药株发生其他位点的突变，86株FQs敏感的菌株在gyrA基因均检测出第95位发生AGC→ACC 突变而其他位点未发生突变，另一株FQs敏感的菌株未发现任何位点的突变，这说明gyrA基因AGC95ACC是遗传多态性的一种表现[4-8]，与FQs耐药性无关。本研究中Ofx 耐药菌株gyrA基因的突变率为84.38%(27/32)，与俄罗斯报道的83%相仿[9]，与国内报道的78%接近[5]。Lfx耐药菌株的突变率为83.33%(25/30), Mfx耐药菌株的突变率为92.86%。Mfx耐药株的突变率稍高于Ofx 耐药株和Lfx耐药株的突变率，可能与Mfx耐药的菌株同时也对Ofx和Lfx耐药有关，而这些FQs耐药的共同机制主要是gyrA基因突变[10]。

本实验32株FQs耐药菌株有27株在gyrA基因发现有义突变，主要突变位于第94位密码子，其次为第90位，再次是第91位。Ofx 耐药株和Lfx耐药株的gyrA基因突变均以Ala90Val最为常见，其次为Asp94Gly和Asp94Asn。Mfx耐药株突变以Asp94Gly和 Asp94Asn为常见。有文献报道gyrA基因第74,83,87,88,89位等[11-12]位点的突变以及同一株菌gyrA基因存在双位点突变[13-14]，而在本研究尚未发现。本次实验有5株FQs耐药菌株(占15.63%)未发现gyrA基因突变，提示了这些菌株可能存在FQs耐药的其他机制，比如gyrB基因突变，药物主动外排泵的过度表达以及细胞膜的通透性下降等[15]，有待进一步深入研究。在福建省临床FQs耐药的MTB分离株中，未发现gyrB基因突变[16]，这充分提示了gyrA基因突变是福建省FQs耐药的MDR-TB临床分离株的主要耐药机制，主要突变位于第94位、第90位、第91位密码子。gyrA基因可以作为福建省FQs耐药的理想分子标记物，通过检测这些位点的突变情况来快速预测FQs是否耐药，从而为临床患者的诊疗赢得时间，减少耐药的传播。

有文献报道[7]gyrA基因Asp94Asn和Asp94Gly可能引起FQs较高水平耐药； Ala90Val和Asp94Ala可能引起FQs低水平耐药。另有报道[8]gyrA基因Asp94Asn只发生在FQs低耐药株，Ala90Val和Asp94Gly在FQs高水平耐药株当中占多数。本研究MDR菌株的突变类型以Asp94Gly，Asp94Asn 和 Ala90Val为主，是否意味着福建省MDR-Mtb菌株以FQs高水平耐药为主，而本次研究仅单纯按照WHO推荐的浓度进行FQs药敏测定，尚未对Ofx耐药的菌株进行最低抑菌浓度(MIC)的检测，因此gyrA基因突变位点与突变类型是否与FQs的耐药水平有关，有待进一步验证研究。

[1] Zhao YL, Xu SF, Wang LX, et al. National survey of drug-resistant tuberculosis in China[J]. N Engl J Med, 2012, 366: 2161-2170.

[2] Alangaden GJ, Manavathu EK, Vakulenko SB, et al. Characterization of fluoroquinolone resistant mutant strains ofMycobacteriumtuberculosisselected in the laboratory and isolated from patients[J]. Antimicrob Agents Chemother, 1995, 39(8): 1711-1713.

[3] Canetti G, Froman S, Grosset J, et al. Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance[J]. Bull World Health Organ, 1963, 29: 565-578.

[4] WHO. Guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis[M]. WHO/HTM/TB/2008. 402. Geneva: WHO, 2008.

[5] Zhao LL, Xia Q, Zhao XQ, et al. Quinolone resistance andgyrgene mutations in multi-drug resistant ofMycobacteriumtuberculosis[J]. Chin J Zoonoses, 2011, 27(5): 390-393. DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2011.05.03 (in Chinese)

赵丽丽，夏强，赵秀芹，等.耐多药结核分枝杆菌对喹诺酮类药物的耐药性与gyr基因突变的初步研究[J].中国人兽共患病学报，2011,27(5):390-393.

[6] Chakravorty S, Aladegbami B, Thoms K, et al. Rapid detection of fluoroquinolone-resistant and heteroresistantMycobacteriumtuberculosisby use of sloppy molecular beacons and dual melting-temperature codes in a real-time PCR assay[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(3): 932-940. DOI:10.1128/JCM.02271-10

[7] Li GL, Chen P, Sun CW, et al. The cross-resistance to levofloxacin and moxifloxacin inMycobacteriumtuberculosisand gene mutations ingyrAandgyrB[J]. Chin J Antituberculosis, 2010, 32(10): 616-621. (in Chinese)

李国利，陈澎，孙昌文，等. 结核分枝杆菌对左氧氟沙星与莫西沙星的交叉耐药性及gyrA和gyrB基因突变分析[J].中国防痨杂志，2010,32(10)：616-621.

[8] Zhao WJ, Li P, Lu Y. Study on the cross-resistance of moxifloxacin and levofloxacin inMycobacteriumtuberculosis[J]. Chin J Antituberculosis, 2009, 31(8): 469-472. (in Chinese)

赵伟杰，李芃，陆宇. 莫西沙星与左氧氟沙星对结核分枝杆菌的交叉耐药性研究[J].中国防痨杂志，2009，31(8)：469-472.

[9] Mokrousov I, Otten T, Manicheva O, et al. Molecular characterization of ofloxacin-resistantMycobacteriumtuberculosisstrains from Russia[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2008, 52(8): 2937-2939. DOI:10.1128/AAC.00036-08

[10] Avalos E, Catanzaro D, Catanzaro A, et al. Frequency and geographic distribution ofgyrAandgyrBmutations associated with fluoroquinolone resistance in clinicalMycobacteriumtuberculosisisolates: A systematic review[J]. PLoS ONE, 10(3): e0120470. DOI: 10.1371/journal.pone.0120470

[11] Huang WL, Lin T, Wu MH, et al. Performance assessment of the GenoType MTBDRsl/test and DNA sequencing for detection of second-line and ethambutol drug resistance among patients infected with multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(7): 2502-2508. DOI: 10.1128/JCM.00197-11

[12] Hu Y, Hoffner S, Wu LL, et al. Prevalence and genetic characterization of second-line drug-resistant and extensively drug-resistantMycobacteriumtuberculosisin rural China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 57(8): 3857-3863. DOI: 10.1128/AAC.00102-13[13] Aubry A, Sougakoff W, Bodzongo P, et al. First evaluation of drug-resistantMycobacteriumtuberculosisclinical isolates from Congo Revealed Misdetection of fluoroquinolone resistance by line probe assay due to a double substitution T80A-A90G in GyrA[J]. PLoS ONE, 9(4): e95083. DOI: 10.1371/journal.pone.0095083

[14] Zhao LL, Chen Y, Liu HC, et al. Molecular characterization of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from China[J]. Antimicrob Agents Chemother, 58(4): 31997-2005. DOI: 10.1128/AAC.01792-13

[15] Chen J, Chen Z, Li Y, et al. Characteristization ofgyrAandgyrBmutations and fluoquinolone resistance inMycobacteriumtuberculosisclinical isolates from Hubei Province, China[J]. Braz J Infect Dis, 2012, 16(2): 136-141.

[16] Chen QY, Pang Y, Liang QF, et al. Molecular characteristics of MDRMycobacteriumtuberculosisstrain isolated in Fujian, China[J]. Tuberculosis, 2014, 94: 159-161.

Phenotypic fluoroquinolones resistance and characteristics ofgyrAmutation in MDRMycobacteriumtuberculosisisolates in Fujian, China

WEI Shu-zhen, ZHAO Yong, LIANG Qing-fu, LIN Jin, LIN Shu-fang

(FujianCenterforDiseaseControlandPrevention/FujianPriorityLaboratoryforZoonoses,Fuzhou350001,China)

Our study investigated the phenotypic fluonoquinolones resistance and the molecular characteristics of mutation ingyrAin MDRMycobacteriumtuberculosis(Mtb) clinical strains in Fujian Province, and provided some reference for rapid molecular detection of fluonoquinolones resistance inMtb. MDR isolates collected from drug resistant survey sites through the province in 2010-2011 and 2007-2008, and the strains were conducted FQs susceptibility testing by proportion method. The quinolone resistant determining region (QRDR) ingyrAwas amplified by PCR and the PCR products were sequenced, the results of sequencing were blasted with H37Rv. Of 119 strains were collected and performed FQs susceptibility testing. The rate of resistant to FQs was 26.89% (Ofloxacin, Ofx), 25.21% (Levofloxacin, Lfx), and 11.76% (Moxifloxacin, Mfx) respectively. No mutation was found ingyrAin fluonoquinolones sensitive MDR strains. The mutation rate ofgyrAin Ofx resistant MDR strains was 84.38% (27/32), the mutation rate of Lfx resistant MDR was 83.33% (25/30), and that of Mfx was 92.86% (13/14). The characteristic ofgyrAmutation in our study was point mutation, with five mutation types, and mainly was Asp94Gly, Asp94Asn and Ala90Val. Thus, we conclude thatgyrAmutation is the main reason of MDR strains resistant to flunoquinolones in Fujian Province. And the most common mutation is in the codon 94, codon 90, and codon 91.

Mycobacteriumtuberculosis; multi-drug resistant; fluoroquinolones; gene mutation

Lin Shu-fang, Email: zqszl@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.005

林淑芳，Email: zqszl@163.com

福建省疾病预防控制中心，福建省人兽共患病重点研究实验室，福州 350001

R378.91

A

1002-2694(2016)10-0876-04

2016-04-27；

2016-08-24

福建省自然科学基金课题(No.2014J01280)资助

Supported by the Fujian Provincial Science Foundation Project (No. 2014J01280)