猪流行性腹泻病毒RT-PCR方法的建立

孔德梦，关冬梅，孔令达，3*

（1.哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 150069；2.沈阳市于洪区动物疫病预防疾控中心，辽宁 沈阳 110141；3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150001）

猪流行性腹泻病毒RT-PCR方法的建立

孔德梦1，关冬梅2，孔令达1，3*

（1.哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江 哈尔滨 150069；2.沈阳市于洪区动物疫病预防疾控中心，辽宁 沈阳 110141；3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江 哈尔滨 150001）

为了进行猪流行性腹泻病毒的快速诊断，本研究根据GenBank中登录PEDV E基因设计一对引物，建立了RT-PCR方法，敏感性结果显示，可以检测到8.50×104个拷贝。特异性试验采用该方法对猪伪狂犬病病毒，猪圆环病毒2型，猪瘟病毒，猪繁殖与呼吸综合征病毒，猪轮状病毒等进行，结果表明只有PEDV能扩增出目的条带；利用本方法对现有PEDV阳性病料进行了检测，结果野毒株9份，占64.2%（9/14）。本方法的建立，为PEDV疫情诊断及防控提供了新的技术支撑。

猪流行性腹泻；分子流行病学调查

猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）属冠状病毒科、冠状病毒属的成员，是引起仔猪腹泻的主要肠道病毒，感染猪以水样腹泻、呕吐、脱水,主要危害仔猪为特征。PED于70年代初首先发现于英国，随后许多国家均有该病的报道。

在我国，PEDV分布较广，灭活苗及弱毒苗在一定程度上控制了该病的发生及流行，但自2010年以来，我国多地暴发流行PEDV，临床上主要表现为哺乳仔猪的高发病率和高死亡率，由腹泻病引起的仔猪死率达高达80%～100%，给养猪业带来了很大的经济损失。随后开展的病原分离鉴定分析、流行病学调查等相关研究，认定PEDV变异毒株是引起本次疾病流行的主要原因。

目前PEDV野毒株与弱毒疫苗株的区别检测技术主要有病毒分离、反转率聚合酶链式反应（RT-PCR）等。本研究采用RT-PCR技术，建立一种快速诊断的方法。

1 材料

1.1 毒株与样品来源猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒等均由本单位保存。

1.2 主要试剂Taq DNA聚合酶，DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；RNA提取试剂盒RNeasy Plus Mini Kit购自QⅠAGEN公司；单链cDNA合成试剂EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix购自全式金生物技术有限公司。Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit购自OMEGA公司；RNAiso Regent、RT（反转录）、2×Taq PCR Master Mix、DNA分子质量标准购自宝生物工程（大连）有限公司；其他常规试剂均为国产分析纯试剂。

2 方法

2.1 引物的设计与合成引物分别参文献设计合成，预期扩增目的片段长度分别为234bp，由宝生物工程（大连）有限公司合成，引物详情见表1。

表1 引物序列

2.2 病毒基因组RNA的提取取PEDV弱毒株（ZJ08）及野毒株（HEBEⅠ08）处理过的样品200μl，按照RNeasy Plus Mini Kit试剂盒说明书操作提取病毒RNA，取一定量提取的RNA产物依照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒反转成cDNA，-20℃保存备用。

2.3 RT-PCR反应

2.3.1 反转录成cDNA按照RT（反转录）试剂盒说明，采用20 μL体系：RNA模板10μL，5×PrimeScript Buffer 4μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1μL，RT Prime Mix 1μL，RNase Free dH20 4μL，按以下程序进行反转录反应：37℃15min，85℃5s，4℃保存。

2.3.2 PCR反应反转录完成后，取新的PCR反应管，采用20μL反应体系进行扩增：加入10μL 2×Taq PCR Master Mix，6μL ddH20，3μL反转录产物，上、下游引物各0.5μL。按照下列条件进行扩增：95℃预变性5min，95℃循环变性30s，PEDV 46℃退火复性30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min，4℃保存备用。

2.3.3 RT-PCR扩增产物的检测及鉴定取扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中电泳，并观察结果。

2.3.4 体系及反应条件优化PCR反应体系预设定为：2× PCR Buffer 10μL，上下游引物各1μL（引物浓度为10μM），cDNA模板1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL（5U/μL），加双蒸水至20μL。PCR反应条件预设为：94℃5min；94℃30 s，50℃30s，72℃30s，30个循环；72℃7min。

固定反应退火温度为50℃，将上、下游引物剂量范围设在0.2～1.6μL以每0.2μL递增，进行引物浓度加入条件的优化，反应结束后，PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测。

确定上、下游引物最佳加入量后，在PCR体系中加入各种成分，设置退火温度梯度48～56℃，反应结束后，PCR产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.3.5 敏感性试验以鉴定正确的含有PEDV序列的重组DNA为模板，核酸蛋白仪测定DNA浓度，双蒸水进行10倍梯度稀释，取每个稀释度的1μL作为模板进行RT-PCR反应。

2.3.6 特异性实验猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型为模板进行RT-PCR检测，同时设强弱毒株为阳性对照，验证RT-PCR的特异性。

2.4 临床样品的检验应用建立的RT-PCR检测方法，对现有的14份PEDV阳性样品进行检测。临床组织样品按常规方法处理后，试剂盒提取RNA并进行反转后得到cDNA。以cDNA为模板进行RT-PCR扩增。

3 结果

3.1 RT-PCR结果利用针对PEDV E基因设计的引物，进行RT-PCR扩增。结果显示，扩增得到与预期目的条带大小相符的特异性片段，约234 bp，如图1所示。对PCR产物克隆、测序分析表明，所得基因序列与GenBank中登录的相应目的基因核苷酸序列同源性均在95%以上，表明扩增产物特异性较高。

图1 部分PEDV的RT-PCR检测结果

M：DL2000 DNA分子量标准；1～3：部分样品PCR产物；4：阳性对照；5：阴性对照

3.2 反应体系优化结果PEDV最终RT-PCR检测体系为：PCR Buffer 10μL，上下游引物各0.8μL（引物浓度为10μM），cDNA模板1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL（5U/μL），加双蒸水至20μL。

反应条件为：94℃5min；94℃30s，51℃30s，72℃30s，30个循环；72℃7min；4℃保存。

3.3 特异性及重复性试验采用设计的扩增PEDV的引物，分别对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型进行RT-PCR扩增，结果显示特异性良好其它病毒均未有目的条带出现，并重复2次实验。结果证实RT-PCR方法具有良好的特异性。

3.4 敏感性试验以初始浓度为8.50×1010拷贝/μL的PEDV重组质粒为模板，经过双蒸水10倍梯度稀释后，取每个稀释浓度的样品进行RT-PCR及普通PCR反应检测。敏感性实验结果表明RT-PCR最低能检出8.50×105拷贝/μL。本实验建立的RT-PCR方法灵敏。

3.5 临床样品检测结果对来自不同地区的14份PEDV阳性样品进行检测，结果显示，以野生强毒株感染为主，且发现了一例混合感染样品。表明当前可能存在免疫后感染的现象。

4 讨论

PEDV是危害养猪业的重要的传染病之一，腹泻二联灭活及弱毒疫苗的使用，对控制该病起到了一定的作用。但从2006年以来，PEDV在免疫后猪群出现流行，2010年下半年开始，PEDV在我国暴发流行，统计数据显示，PEDV的感染率明显高于另外两种猪腹泻病猪传染性胃肠炎（TGEV）及猪轮状病毒（PRoV）。报道称2010年开始在中国南方有多个省暴发PEDV且导致新生仔猪100%的死亡率，有超过100万头仔猪死亡。华中地区182家猪场表现严重腹泻的猪的粪便样本阳性检出率为60.44%，47个规模猪场共153份腹泻病料样品，阳性检出率为55.32%，表明近几年在我国PEDV是导致腹泻的主要原因。

猪病毒性腹泻疾病有爆发性流行、地方性流行两种形式。一般第一次感染均呈暴发性流行，一些猪传染性胃肠炎病毒污染比较严重的猪场，常呈地方性流行。冬春季节是病毒性腹泻疾病的多发季节，猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎的发生和流行具有明显的季节性，通常从11月到次年4月中旬，发病高峰为1～2月份，但现在夏季也可发病。病猪和带毒猪群是主要传染源，主要通过消化道和呼吸道传染给易感猪群，但在实验室平日检测时发现母猪乳汁中也能检测到PEDV和TGEV的存在，乳汁传播是否是其传播途径还有待进一步研究。2周龄以下仔猪发病率和死亡率较高，7日龄以内的产房仔猪腹泻最为严重，表现为迅速出现水样腹泻，严重脱水和死亡。断奶仔猪断奶猪和育肥猪表现持续性的水泻，大多数病猪康复，但生长发育受影响，成为僵猪。母猪表现精神萎顿，厌食，腹泻持续约1周。在临床上很难单凭腹泻这一多因子致病症状进行准确的诊断，因此进行相应的分子流行病学调查显得尤为重要。本方法的建立，为PEDV疫情诊断及防控提供了新的技术支撑。

［1］殷震，等.动物病毒学［M］.北京∶科学出版社.1997.

［2］Debouck P，Pensaert M.Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus，CV 777［J］.American journal of veterinary research，1980，41（2）∶219-223.

［3］赵梦姣，等.山东省部分地区猪流行性腹泻流行病学调查及其M基因遗传变异分析［J］.中国兽医学报.2013，33（010）∶1504-1508.

［4］孙振钊，等.猪腹泻病例中PEDV、TGEV及PRV的感染调查［J］.动物医学进展，2014，35（5）：132-135.

［5］刘孝珍，等.2011年猪流行性腹泻病毒的遗传变异分析［J］.中国预防兽医学报，2012，34（3）∶180-183.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．04.016

★通讯作者