健脾疏肝和胃方对功能性消化不良大鼠Cajal间质细胞及胃排空的影响

李晓燕，陈维，陈文玲

(云南中医学院第一附属医院，云南 昆明 650031)



健脾疏肝和胃方对功能性消化不良大鼠Cajal间质细胞及胃排空的影响

李晓燕，陈维*，陈文玲

(云南中医学院第一附属医院，云南 昆明 650031)

目的:观察健脾疏肝和胃方对功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)大鼠胃排空(gastric emptying,GE)、c-Kit阳性Cajal间质细胞(interstitial cells of cajal，ICC)及其表达的影响，探讨其可能的作用机制。方法:将大鼠随机分成对照组、模型组、健脾疏肝和胃方组、多潘立酮组，采用夹尾刺激法建立FD大鼠模型，连续给药14天后，采用半固体营养糊法观察胃排空，胃高倍镜下Cajal间质细胞计数，采用实时荧光定量PCR法检测胃平滑肌组织kit mRNA表达，Western blot法检测胃平滑肌组织kit表达。结果:与对照组相比，模型组胃排空延迟、胃底c-Kit 阳性ICC表达显著降低(P均<0.05)；与模型组相比，健脾疏肝和胃方组及多潘立酮组胃排空、c-Kit 阳性ICC数量及表达显著升高(P均<0.05)。结论:健脾疏肝和胃方组可以明显增加FD大鼠胃底ICC表达，加快胃排空；上调ICC、提高大鼠胃排空率可能是健脾疏肝和胃方治疗功能性消化不良的作用机制之一。

功能性消化不良；大鼠；健脾疏肝和胃方；Cajal间质细胞

功能性消化不良(functional dyspepsia，FD) 是一种临床常见的消化道疾病，发病机理复杂，临床治疗药物多样，但病情容易反复。因此，寻找具有多靶点、疗效确切、副作用小的防治药物无疑是一项有意义的研究。

健脾疏肝和胃方是云南省名中医帅焘教授临床应用多年的治疗肝胃不和之腹痛的经验方，前期的临床观察[1]发现疗效较好。本研究以FD大鼠为观察对象，从Cajal间质细胞(interstitial cells of cajal，ICC)、胃排空(gastric emptying，GE)的层面，研究该方治疗FD的可能作用机制。

1 材料

1.1 动物

40只SPF级SD大鼠，体质量(200±20)g，适应性喂养1周，随机分为正常对照组、模型组、西药组和中药组，每组10只。正常对照组正常喂养，其余3组均按照参考文献[2]采用郭氏夹尾激怒法制造FD大鼠模型。

1.2 药物

健脾疏肝和胃方(枳实10 g，白术20 g，柴胡12 g，白芍10 g，木香10 g，香附10g，延胡索10 g，川楝子8 g，厚朴20 g，槟榔10 g等)，购自云南中医学院第一附属医院药剂科;多潘立酮片(西安杨森制药有限公司，批号140107137)。药物制备方法:将中药材按传统方法水煎并加热浓缩成浸膏，置4℃冷藏备用。

1.3 试剂与仪器

Rabbit Anti-C-KIT(BA0467，美国Santa cruz公司)；PCR扩增仪(美国ABI公司)；荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；冷冻离心机(德国thermo公司)；JY3002 型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

2 方法

2.1 给药方法

造模结束后开始灌胃给药，按照大鼠与人临床用药剂量、体型系数公式dB=dA×RB/RA×(WA/WB)1/3计算大鼠药物剂量，中药组给予健脾疏肝和胃生药13.5 g/kg，阳性药物对照组给予多潘立酮1.0 mg/kg，模型组及正常对照组给予生理盐水,每日1次，连续14天。给药14天后禁食不禁水24 h。

2.2 样本处理

参照文献[3]制作半固体糊，冰箱冷藏，用时恢复至室温。末次给药2 h后各组给予灌入半固体糊，1.0 g/只，40 min后断头处死大鼠。打开腹腔，结扎贲门和幽门，取下整胃，用滤纸拭干后称胃全重。沿大弯侧切开胃，以蒸馏水冲洗胃内容物，滤纸拭干后称胃净重。胃底部取胃壁全层大小约0.5 cm×0.5 cm 2块，一块置于2.5%戊二醛、液氮中，备电镜检测。一块用10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，片厚4 μm，烤片30 min，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，每次10 min。然后洗涤、修复液修复、浸泡，依次加入一抗、二抗，镜下观察，以棕黄色为阳性反应；PBS 冲洗，HE 染色、冲洗、酒精滤泡，中性树胶封片观察。

2.3 指标检测

2.3.1 按照公式计算胃排空

胃排空率(%)=[1-(胃全重-胃净重)/腹腔注射量]×100%

2.3.2 胃平滑肌组织kit mRNA表达

采用实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)，以GAPDH 为内参，检测kit的mRNA表达(步骤：提取组织总RNA-引物-逆转录cDNA-Real time PCR 反应体系扩增-目的基因相对mRNA表达水平分析)。

2.3.3 Western blot检测胃平滑肌组织kit表达

提取蛋白样品80 μg，SDSPAGE凝胶电泳分离，凝胶电泳仪初始电压80 V，后提高电压至100 V，用PVDF膜进行蛋白质的电转移，用5%TBS-T脱脂奶粉封闭。用TBS-T漂洗液洗膜，加入用适当漂洗液稀释的抗体(c-kit为1∶200；β-actin为1∶5000)，4℃孵育过夜。TBS-T漂洗液洗膜3次，然后将PVDF膜移入另一新的杂交袋，加入漂洗液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗(c-kit 为1∶2000；β-actin为1∶10000)，37℃振荡60 min，TBS-T漂洗液洗膜。加入化学发光剂曝光、显影。蛋白图像分析用IPP软件对扫描图象的目的条带进行分析。

2.3.4 统计学处理

3 结果

3.1 基本情况

造模7天后，造模大鼠均有体质量增长缓慢、饮水、饮食量逐渐减少，毛发枯黄、不光滑等表现。

3.2 各组大鼠胃底ICC 表达比较

模型组大鼠胃底c-Kit mRNA及蛋白表达较正常对照组明显减少(P<0.05);中药组与模型组相比阳性表达增多，有统计学意义(P<0.05)。见表1及图1～3。

3.3 胃排空

模型组大鼠胃排空率较正常对照组明显减少(P<0.05);中药组与模型组相比胃排空率升高，差异有统计学意义(P<0.05)；中药组与西药组差异无统计学意义。见表1。

表1 各组大鼠胃底ICC 表达比较

注:与正常组相比，1)P<0.05;与模型组相比，2)P<0.05。

图1 免疫组化检测FD模型大鼠胃底肌肉层c-kit蛋白变化注:图中所示为药物干预后各组大鼠胃底肌肉层的免疫组化照片，1为空白对照组大鼠胃底肌肉层(×100)，2为模型对照组(×100)，3为西药对照组(×100)，4为中药组(×100)。

图2 Western Blot检测FD模型大鼠胃底肌肉层c-kit含量

3.4 Western Blot检测c-kit蛋白表达结果

上图为四组大鼠在药物干预后Western Blot检测c-kit蛋白的表达含量结果胶片扫描图片；下图为采用Bio-Rad的Quantity one软件分析胶片后的c-kit不同组间表达趋势变化。

3.5 RT-PCR检测c-kit mRNA结果

图3 RT-PCR检测FD模型大鼠胃底肌肉层c-kit mRNA含量变化

相较于空白对照组的SD大鼠，模型对照组的大鼠胃底肌肉层中Cajal细胞含量都明显降低。Western Blot方法检测显示模型对照组的c-kit蛋白含量为空白对照组的21.2%(P<0.05，见图2)，RT-PCR方法检测模型对照组c-kit mRNA含量为空白对照组的7.8%(P<0.05，见图3)，免疫组化检测显示c-kit含量在模型对照组的SD大鼠胃底肌肉层的含量明显低于空白对照组(P<0.05)(见图1)，这说明SD大鼠的FD模型构建比较成功。而在药物干预14天后，相较于模型对照组，西药组和中药组的大鼠胃底肌肉层的c-kit蛋白，c-kit mRNA，以及Cajal细胞含量都有所提升。其中西药组的c-kit蛋白含量提升为239%，有统计学意义(P<0.05)，中药组提升为139%(P<0.05)，如图2中所示；西药组的c-kit mRNA含量提升为331%(P<0.05)，中药组提升为159%(P<0.05)，见图3；免疫组化照片显示西药组和中药组大鼠胃底肌肉层中的Cajal细胞的含量也较于模型对照组有所提升(图1)。中药组较西药组低且差异有统计学意义(P<0.05)。

4 讨论

FD的发病机制复杂多样，研究显示30%～80% 的FD 患者存在消化道运动障碍[4]。目前已证实ICC 在胃肠电生理和动力发生及动力障碍机制上具有重要作用[5]。本实验发现，模型组大鼠胃窦c-Kit 阳性ICC与对照组比较明显减少(P<0.05)，并且胃排空率明显降低，ICC数量下降可能导致胃肠平滑肌松弛，胃蠕动减弱，从而出现胃排空时间延长等功能障碍。用健脾疏肝和胃方治疗后，大鼠c-Kit mRNA及蛋白阳性表达均较模型组增加、胃排空率显著升高(P均<0.05)。中药组与模型组相比各项指标升高且差异无统计学意义。综上，健脾疏肝和胃方促进胃排空，可能通过上调ICC表达有关，但可能还存在其他作用机制，有待于今后进一步研究。

[1] 李晓燕，石颖．健脾疏肝和胃法治疗功能性消化不良42例[J].中国中西医结合消化杂志，2012,20(3)：128-129.

[2] 郭海军,林洁,李国成,等.功能性消化不良的动物模型研究[J].中国中西医结合消化杂志,2001,9(3):141-142.

[3] 孙永顺，尚盈盈，朱生樑.丁香降气方对反流性食管炎大鼠胃排空及Cajal间质细胞影响的实验研究[J].新中医，2012，44(10)：130-133.

[4] 张晓光，胡品津，林金坤，等.功能性消化不良患者胃感觉运动功能的研究[J].中华消化杂志，2003，23(4) :227-229.

[5] Daniel EE. Communication between interstitial cells of Cajal and gastrointestinal muscle[J].Neuro gastroenterol Motil，2004，16(1):118.

Effect of Jianpi Shugan Hewei Decoction on Expression of Interstitial Cells of Cajal in Functional Dyspepsia Rats

LI Xiao-yan，CHEN Wei*，CHEN Wen-ling

(TheFirstAffiliatedHospitalofYunanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Kunming650031，China)

Objective:To observe the effect and mechanism of Jianpi Shugan Hewei decoction on expression of gastric emptying and interstitial cells of cajal(ICC) in functional dyspepsia(FD) rats. Methods:FD model was induced by moderately enraging the rats' tail. All rats were randomly divided into 4 groups:a control group，a model group，a Chinese herbology group and a western medicine group. Drugs were administrated for 14 days. ICC and GE were determined by immunohistochemical method. Gastric emptying was observed with phenolsulfonphthalein. Results:Compared with the control group，gastric emptying and the expression of ICC in the model group were obviously decreased (P<0.05). Compared with the model group，gastric emptying and ICC increased significantly in Chinese herbology group and western medicine group(P<0.05). Conclusion: Jianpi Shugan Hewei decoction may increase diet and water intake，promote ICC expression in FD rats and accelerate gastric emptying.

Functional dyspepsia;Rats;Jianpi Shugan Hewei decoction;Interstitial cells of Cajal

云南省教育厅课题(No.2013Y235)

李晓燕(1975-)，女，副教授，主要从事脾胃病及老年病的临床教学及科研工作。

陈维*(1979-)，男，讲师，主治医师，博士，主要从事中西医结合内科学临床、科研与教学工作。

2015-10-21

R285.5

A

1002-2406(2016)05-0045-03

修回日期：2015-11-10