有机酸对甘草呼吸代谢及甘草酸积累的影响

杨春宁，孙志蓉 ，曲继旭，刘晓欣，刘文兰，朱南南，程丽丽

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)



中 药 研 究

有机酸对甘草呼吸代谢及甘草酸积累的影响

杨春宁，孙志蓉*，曲继旭，刘晓欣，刘文兰，朱南南，程丽丽

(北京中医药大学中药学院，北京 100102)

目的：研究丙酮酸和琥珀酸两种有机酸对甘草呼吸代谢及甘草酸积累的影响，从生理学的角度探讨呼吸作用与甘草酸积累之间的关系。方法：采用溶氧法测定甘草根系呼吸速率；蒽酮比色法测定可溶性糖和淀粉的含量；2,4-二硝基苯肼显色法测定丙酮酸的含量；Elisa试剂盒法测定乙酰辅酶A的含量；高效液相色谱法测定甘草酸的含量。结果：丙酮酸和琥珀酸对甘草的呼吸代谢具有促进作用，其作用大小为：琥珀酸组>丙酮酸组>对照组；对呼吸底物可溶性糖和淀粉的影响为琥珀酸组比丙酮酸组和对照组具有更高的积累，分别是对照组的1.02倍和1.04倍，是丙酮酸组的1.15倍和1.04倍；对中间物质丙酮酸含量具有极显著影响(P<0.01)，但对乙酰辅酶A的影响差异不显著(P>0.05)；对甘草酸含量具有一定影响，丙酮酸组甘草酸含量高于其他两组，分别为对照组和琥珀酸组的1.24倍和1.05倍。结论：有机酸能够通过调节甘草根系呼吸作用强弱来调节甘草酸的合成积累。

甘草；呼吸代谢；丙酮酸；琥珀酸；甘草酸

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)是常用大宗中药材，广泛应用于制药工业及饮料、调味品、香烟、糖果等行业，因其需求量不断增加，野生资源日益减少[1]，人工栽培甘草规模在逐渐扩大。但目前多数人工栽培甘草中甘草酸的含量达不到《中国药典》规定的大于2%的要求[2]。在人工栽培甘草方面，虽然已经完成了甘草由野生到栽培的驯化工作，且人工栽培甘草的技术和方法也在不断成熟和完善[3-6]，但目前影响甘草酸积累的相关机制尚不明确，甘草酸含量低的问题还没有得到解决。植物的呼吸代谢是物质与能量代谢的重要途径[7]，为次生物质的生成提供重要的中间物质和能量。乙酰辅酶A(CoA)是甘草酸合成的初始供体[8],其主要来源为呼吸作用中的糖酵解途径。丙酮酸是细胞中无氧呼吸与有氧呼吸的重要中间产物，在有氧条件下，丙酮酸转化为CoA进入三羧酸循环(TCA)，生成有机酸和NADH，丙酮酸还是呼吸作用的潜在调节因子，丙酮酸等α-酮酸能够刺激交替氧化酶(AOX)活性增强[9]；琥珀酸是植物体内进行三羧酸循环的重要中间产物，有研究表明琥珀酸能够影响植物体的呼吸速率[10]。目前有机酸对甘草根系呼吸作用及甘草酸积累影响方面的研究还未见报道。本文通过外源丙酮酸、琥珀酸处理，考察有机酸对甘草根系呼吸代谢和甘草酸积累的影响，探讨甘草呼吸代谢与甘草酸积累的相关关系，为提高人工栽培甘草质量提供研究资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为甘草当年播种苗。种子由内蒙古伊克昭盟杭锦旗甘草公司提供。采用无土栽培法，高温灭菌后，按蛭石：珍珠岩体积比为4:1的比例充分混匀，装于塑料花盆中，盆高16 cm，盆外口直径为25 cm，内口直径为21 cm。将盆按照随机数字法分好组后放入北京中医药大学培养室内，浇透水2天后，播种。当地上部分长至20 cm左右时开始间苗，每盆留苗20株。待甘草芦头直径长至1.0 cm左右时开始进行有机酸处理，分别设置空白对照组，丙酮酸组和琥珀酸组3个处理组，丙酮酸组和琥珀酸组分别施以浓度均为8 mmol/L的丙酮酸钠和琥珀酸溶液(溶液用盐酸和NaOH溶液调pH值至7.5左右)，每7天浇1次，每次1800 mL，空白对照组以等量清水代替。

1.2 试验方法

1.2.1 甘草根系总呼吸强度的测定

分别在实验处理后的第1 d、3 d、7 d、14 d和28 d时，人工气候室内光照处理2 h后采集甘草，选择甘草中上部主根，剪成长约1 mm左右根段，将其分成三个不同的对照组，每组含20个根段，每组将根段放入Yaxin-1151生物氧测定仪叶室内，用0.2 M的Tris填充整个叶室后，将氧电极插入叶室中开始进行测定。每个样品测定4～5 min，每组至少5个平行。上述实验过程在25℃空调房中进行。

1.2.2 甘草呼吸底物和中间物质含量的测量

可溶性糖和淀粉的含量测定采用蒽酮比色法[11]加以改进。丙酮酸含量测定采用2，4-二硝基苯肼显色法[12]加以改进。乙酰辅酶A选用植物乙酰辅酶A(A-COA)Elisa 试剂盒进行测定。

1.2.3 甘草酸含量的测量

采用周香珍[13]的方法加以改进。

1.3 数据统计分析方法

采用EXCEL 2010进行数据录入和图表绘制。采用SPSS20.0软件进行One-way ANOVA方差分析，Kruskal-Wallis H(K)非参数检验，LSD检验法进行多重比较。

2 结果

2.1 有机酸对甘草总呼吸强度的影响

有机酸处理后，甘草的根系呼吸产生相应的变化，如图1所示。不同取样时间各处理组甘草根系总呼吸差异较明显，有机酸溶液处理后第1 d，各组甘草根系总呼吸速率显著低于其他时间的测定值，第3 d时，各组处理组的呼吸速率明显增大。处理第3 d、7 d、14 d和28 d测定的各组甘草根系呼吸值差异不大(P>0.05)。相同取样时间各处理组间甘草根系总呼吸强度也不同，除第1 d外，各处理组间根系呼吸速率大小为：琥珀酸组>丙酮酸组>对照组。第1 d时，丙酮酸组>琥珀酸组>对照组。

图1 丙酮酸、琥珀酸对甘草根系总呼吸速率的影响

2.2 有机酸对甘草呼吸底物、中间物质的影响

2.2.1 有机酸对甘草呼吸底物的影响

糖类通过呼吸代谢产生各种有机酸和能量，是根系呼吸的底物。由表1可见，丙酮酸处理组甘草根系的可溶性糖与对照组相比有所下降，是对照组的0.89倍；但淀粉含量与对照的1.08倍；琥珀酸处理组的可溶性糖和淀粉的含量均高于对照组，分别是是对照组的1.02倍和1.04倍。琥珀酸组甘草根系的可溶性糖和淀粉的含量分别为丙酮酸组1.15倍和1.04倍。各处理组甘草根系中可溶性糖和淀粉的含量没有显著性差异。

表1 不同处理组甘草呼吸代谢底物的含量及其方差分析±s)

2.2.2 对呼吸中间产物的影响

丙酮酸可以通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现生物体内糖、脂肪和氨基酸间的相互转化。因此丙酮酸和乙酰辅酶A是参与整个生物体基本代谢的中间物质。丙酮酸和琥珀酸对甘草中间产物的影响如表2所示，不同处理组中丙酮酸和乙酶辅酶A含量有差异。各组间丙酮酸含量影响极显著(P<0.01)，丙酮酸组最高，达到84.65 μg/g，是对照组甘草的1.12%；琥珀酸组甘草的丙酮酸含量最低，是空白组和丙酮酸组的90.29%和80.87%。各组间乙酰辅酶A含量差异不显著(P>0.05)，丙酮酸组甘草中乙酶辅酶A含量较低，其含量为0.55 pmol/g，比对照组低14.54%；琥珀酸组甘草的乙酰辅酶A含量最高，为0.68 pmol/g，比对照组高0.05 pmol/g。

表2 不同处理组甘草中间产物的含量及其方差分析±s)

2.3 有机酸对甘草酸含量的影响

各处理组甘草中甘草酸含量有差异。丙酮酸组甘草酸含量高于其它两组，分别为对照组和琥珀酸组的1.24倍和1.05倍。与对照组相比，琥珀酸组甘草根系中甘草酸含量略低，为0.240%，是对照组的0.97倍(见表3)。

表3 不同处理组甘草甘草酸含量及其方差分析表±s)

3 结论

植物在呼吸代谢中能够产生多种有机酸，丙酮酸和琥珀酸均是参与三羧酸循环(TCA)的重要中间物质，并对植物体的呼吸具有很强的刺激作用[10]。施加外源丙酮酸和琥珀酸能够对甘草的根系呼吸产生促进作用：除第1 d外，琥珀酸组甘草的根系总呼吸最强，其次为丙酮酸组，对照组的甘草根呼吸值最小，并且琥珀酸的呼吸作用大于丙酮酸，这与TCA在呼吸作用的所占有较大比例[14]具有一致性。丙酮酸和琥珀酸处理影响了甘草根系总呼吸速率，对比相同取样时间(除第1 d外)，各组间差异趋势基本一致：琥珀酸组甘草的根系总呼吸最强，其次为丙酮酸组，对照组的甘草根呼吸值最小。说明这两种有机酸对甘草根系总呼吸具有促进作用。

丙酮酸和琥珀酸可以影响甘草根系的呼吸底物和中间物质含量，对呼吸底物具体的影响为：可溶性糖含量丙酮酸组最低，琥珀酸组含量最高，分别为对照组的0.89倍和1.02倍；淀粉含量丙酮酸组和琥珀酸组均高于对照组，分别是对照组的1.06倍和1.12倍。说明加入丙酮酸可以增加可溶性糖的消耗，加入琥珀酸能够增加糖类的积累。丙酮酸处理显著提高甘草根系中丙酮酸的含量，使乙酶辅酶A含量降低；琥珀酸处理使甘草根系中丙酮酸的含量减少，乙酶辅酶A含量升高。丙酮酸处理组丙酮酸含量差异极显著(P<0.01),且其含量最多为84.65 μg/g，但乙酰辅酶A的含量却最低为0.55 μg/g。

有机酸对甘草酸含量的影响丙酮酸组甘草酸含量高于其他两组，分别为对照组和琥珀酸组的1.24倍和1.05倍。与对照组相比，琥珀酸组甘草根系中甘草酸含量略低，是对照组的0.97倍。在有氧条件下，丙酮酸分别经丙酮酸脱氢酶复合体和丙酮酸羧化酶作用下催化形成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A与草酰乙酸结合进入三羧酸循环。本试验结果显示，与其他两组相比，丙酮酸处理组三羧酸循环增强，乙酰辅酶A含量降低，说明丙酮酸处理在提高甘草根系中丙酮酸含量的同时增强了三羧酸循环，乙酰辅酶A消耗加快导致自身含量降低。同时，丙酮酸组甘草酸含量比其他组含量高，说明乙酶辅酶A作为甘草酸合成的初始供体，由于处在代谢的“分支点”，其含量高低对甘草酸积累有影响。

综上所述，有机酸可以通过调节甘草的呼吸作用强弱来调节初生物质与次生物质的代谢。但是有机酸影响甘草酸积累的机理目前还不清楚。三羧酸循环的强弱可以直观的反映植物的呼吸耗氧，所以我们推测：有机酸对甘草酸积累的影响，很可能是通过影响甘草根系呼吸代谢中的三羧酸循环产生的。因为三羧酸循环一方面可以影响中间物质的代谢，另一方面可以影响植物的能量代谢。三羧酸循环是物质与能量的代谢中心，是根系呼吸代谢的重要枢纽，特别对以根和根茎类药材的中药活性物质的合成具有重要作用，期望通过进一步的试验证实三羧酸循环与甘草酸的关系，为提高人工栽培甘草中甘草酸的含量提供理论依据。

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国家自然科学基金面上项目(No.81573524)

杨春宁(1990-)，男，北京中医药大学2014级硕士研究生，主要从事中药材质量及调控机制研究工作。

孙志蓉*(1967-)，女，副教授，硕士研究生导师，主要从事中药质量与开发研究工作。

2016-02-18

R28

A

1002-2406(2016)05-0001-03

修回日期：2016-03-01