血清miR-221表达水平对老年哮喘的诊断价值

吴 琼，刘锦铭



·临床医学·

·论著·

血清miR-221表达水平对老年哮喘的诊断价值

吴 琼，刘锦铭

目的 检测老年哮喘患者的血清miR-221表达水平，并评价血清miR-221对老年哮喘的诊断价值。方法 选取我院109位老年哮喘患者(实验组)和115位健康老年人(对照组)。采用RT-PCR检测2组老年人血清miR-221表达水平，并对结果进行ROC曲线绘制。Elisa法测定2组老年人血清白细胞介素(IL)-4和IL-12浓度，同时对2组老年人进行肺功能检测。最后应用Spearman相关分析计算血清miR-221表达水平与血清细胞因子浓度和肺功能参数的相关性。结果 与对照组比较，实验组患者血清miR-221表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线绘制结果显示，血清miR-221的诊断阈值为1.37。实验组和对照组患者的血清IL-4浓度、血清IL-12浓度、FVC值、FEV1值和PEF值差异均存在统计学意义(P<0.05)。用Spearman相关分析发现，血清miR-221表达水平与血清IL-4浓度、血清IL-12浓度、FVC值、FEV1值和PEF值均存在显著相关性(P<0.05)。结论 血清miR-221的表达水平可以作为老年哮喘病情判断指标，同时也为老年哮喘的临床治疗开辟了新思路。

老年哮喘；miR-221；白细胞介素-4；白细胞介素-12；肺功能；诊断

支气管哮喘(简称哮喘)是一类老年人群体常见的慢性呼吸系统疾病，可以导致患者出现气道炎症、气道高反应、黏液分泌增多和气道阻塞等症状[1-2]。近年来哮喘的发病率和死亡率均呈现逐年增加的趋势[3]，因此，及时对哮喘做出正确诊断对改善老年患者的预后十分重要。虽然哮喘发病的根本原因目前尚不完全明晰，但大量的研究[4]均已表明，microRNA(miR)在哮喘发病中起到了十分重要的作用。近年来，研究发现miR-21、miR-145、miR-221等均与哮喘的发病进程密切相关[5]。miR-221不仅在老年哮喘患者血清中呈现显著高表达，同时哮喘小鼠模型也验证了miR-221能够促进白细胞介素(IL)-4的分泌[6]。因此，笔者推测血清miR-221是一种合适的老年哮喘诊断标志物。相较于其他老年哮喘诊断方法，血清诊断具有简便快捷、费用低廉的优势。本研究着重检测老年哮喘患者血清miR-221的表达水平，并通过绘制ROC曲线获得诊断阈值，最后应用Spearman相关分析计算血清miR-221的表达水平及其与血清细胞因子浓度和肺功能参数的相关性，从而综合评价血清miR-221的表达水平对老年哮喘的诊断应用价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象 实验组共选取2013年8月至2015年12月在我院就诊的老年哮喘患者109例，其中男性50例，女性59例，所有患者均符合中华医学会全国哮喘学术会议制定的诊断标准。患者年龄60～77岁，平均(68.9±5.0)岁。对照组随机选取在本院呼吸科门诊体检的115例无家族疾病史的健康老年人，其中男性54例，女性61例，年龄60～78岁，平均(69.2±4.9)岁。2组患者在年龄、性别、民族和居住地等比较差异均无统计学意义(P<0.05)。本研究已获得医院伦理委员会的批准，2组老年本人或其子女签署书面知情同意书。

1.2 血清采集 2组老年人分别于清晨空腹采集2 ml外周静脉血于干燥试管内，室温100×g离心10 min后收集上层血清，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 血清miR-221表达水平检测 2组老年人均取1 ml血清，应用TRIZOL试剂盒(购自美国Invitrogen公司)提取血清总RNA。应用TaqMan®MicroRNA逆转录试剂盒(购自美国Fermentas公司)将提取的RNA反转录成cDNA。应用TaqMan®Gene Expression Assay试剂盒(购自美国Fermentas公司)对miR-221和内参U6进行实时定量PCR(RT-PCR) 扩增。设定扩增反应条件为：95 ℃预变性15 min后，94 ℃变性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40个循环。miR-221的相对表达水平采用2-△△Ct法进行分析，即ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt，而ΔCt=miR-221Ct-U6 Ct。所用引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列

基因名引物序列miR-221正向5'-AGCUACAUUGU-CUGCUGGGUUUC-3'反向5'-GAAACCCAGCAGACAAUGUAGCU-3'U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

1.4 血清细胞因子浓度检测 2组老年人均取1 ml血清，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法定量检测血清IL- 4、IL-12浓度，ELISA试剂盒均购自深圳晶美生物制品公司，严格按照产品说明书进行操作。

1.5 肺功能检测 采用日本美能AS-500便携式肺功能仪，由肺功能室专人负责对2组老年人进行肺功能检测。检测时要求受试者站直或坐直，保持头部自然水平，夹上鼻夹，口唇包上紧口器，松解过紧的腰带及衣物领口等，检测过程中依据检测情况决定检测次数，并选择最合适的数值进行记录。检测的主要参数包括用力通气量(forced vital capacity，FVC)、第1秒用力呼气量(forced expiratory volume in one second，FEV1)和最大呼吸峰流速(peak expiratory flow，PEF)值，需要注意的是肺活量受年龄、性别、身高、体表面积等的影响，正常人群为(100±20)%，<80%为减少。所有参数均以实测值占预计值的百分比表示，以预计值百分率作为指标来判断。

1.6 统计学处理 本实验应用SPSS 19.0和GraphPad统计软件进行数据统计分析。计量资料均以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验。根据检测结果绘制ROC曲线，根据ROC曲线下面积和诊断阈值确定相对应的敏感性和特异性。采用Spearman相关分析计算血清miR-221表达水平与血清细胞因子浓度和肺功能检查参数的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清miR-221表达水平检测RT-PCR检测2组老年人血清miR-221表达水平，结果如图1所示。实验组血清miR-221表达水平为2.04±0.32，而对照组血清miR-221表达水平为1.00±0.19，2组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

注：与对照组比较aP<0.05图1 对照组和实验组老年人血清miR-221表达水平比较

2.2 绘制ROC曲线 根据血清miR-221检测结果绘制ROC曲线，其曲线下面积为0.933，诊断阈值为1.37，敏感性为94.0%，特异性为85.2%。说明血清miR-221可以用作一种潜在的检测标志物用于诊断老年哮喘。见图2。

图2 血清miR-221表达水平的ROC曲线

2.3 血清IL-4、IL-12水平检测 实验组血清IL-4浓度为(124.89±35.25)ng/L，而对照组血清IL-4浓度为(51.32±19.03)ng/L，老年哮喘患者血清IL-4浓度明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。实验组血清IL-12浓度为(36.06±10.13)ng/L，而对照组血清IL-12浓度为(62.33±12.37)ng/L，老年哮喘患者血清IL-12浓度明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

注：与对照组比较aP<0.05。A为血清IL- 4浓度比较，B为血清IL-12浓度比较图3 对照组和实验组老年人血清细胞因子IL- 4、IL-12浓度比较

2.4 肺功能检测 实验组FVC为(72.39±25.76)%，而对照组FVC为 (102.83±17.93)%。相较于健康老年人，老年哮喘患者FVC出现明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。实验组FEV1为(69.23±21.73)%，而对照组FEV1为(104.38±13.72)%。相较于对照组，老年哮喘患者FEV1出现明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。PEF为(69.31±22.18)%，而对照组PEF为(107.97±24.21)%，实验组患者PEF明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 对照组和实验组老年人肺功能参数比较(%，x±s)

注：FVC为用力通气量，FEV1为第1秒用力呼气量，PEF为最大呼吸峰流速；与对照组比较aP<0.01

2.5 Spearman相关分析 采用Spearman相关分析，血清miR-221表达水平与血清IL-4浓度呈显著正相关(P<0.05)，而与血清IL-12浓度、FVC值、FEV1值和PEF值均呈显著负相关(P<0.05)，提示老年哮喘患者血清miR-221的异常表达与其血清细胞因子的异常浓度和肺功能的受损情况存在相关性。见表3。

表3 血清miR-221表达水平与血清细胞因子和肺功能检测结果的相关性分析

注：FVC为用力通气量，FEV1为第1秒用力呼气量，PEF为最大呼吸峰流速，IL- 4为白细胞介素- 4，IL-12为白细胞介素-12

3 讨论

老年哮喘患者的症状表现及体征差异较大，临床诊断时比较容易出现误诊和漏诊。在临床实践中，除肺功能检查、痰液嗜酸粒细胞或中性粒细胞计数以外，血清中某些生物标记物的异常变化亦可作为诊断老年哮喘的参考依据。与蛋白质和mRNA相比，miRNA长度较短，因此患者的血清miRNA表达水平更容易被一些常规实验技术如RT-PCR检测到。

作为一种非编码小分子RNA，miRNA能够由不同细胞表达并分泌进入外周血循环，其在血清中的异常表达常与癌症、神经系统疾病、心血管系统疾病等多种人类疾病密切相关[7]。近年来大量研究发现，miR-221在乳腺癌[8]、前列腺癌[9]、胃癌[10]等疾病中均出现异常表达，被认为可以作为这些癌症的早期诊断标记物。肥大细胞的数量在哮喘患者的气道中明显增加[11]，而miR-221与气道肥大细胞的增殖密切相关[6]。本研究对血清miR-221在老年哮喘患者和健康老年人中的表达水平进行了检测比较，结果显示老年哮喘患者的血清miR-221出现异常高表达，这与以前在儿童哮喘中的研究结果相一致[12]。ROC曲线绘制结果提示血清miR-221因其高敏感性和特异性，可以用作老年哮喘的诊断标志物之一。有研究[2]表明，Th1和Th2细胞亚群的免疫反应失衡是哮喘发病的核心因素，Th1细胞数量出现显著下降，而Th2细胞数量出现显著上升。Thl主要分泌IL-12等Thl型细胞因子，参与细胞免疫；Th2主要分泌IL-4等Th2型细胞因子，参与体液免疫。本研究发现老年哮喘患者的血清IL-4浓度显著高于健康老年人，而血清IL-12浓度显著低于健康老年人，这与以前在儿童哮喘研究中的结论相一致[13]。而肺功能检测结果显示，相较于健康老年人，老年哮喘患者的肺功能出现了显著性损伤。此外，Spearman相关分析结果也提示血清miR-221表达水平的变化能在一定程度上反应老年哮喘患者体内免疫反应的异常和肺功能受损情况，miR-221的异常表达可能也与Th1和Th2细胞亚群的失衡存在一定的关联。

综上所述，血清miR-221诊断老年哮喘快速有效，具有较高的敏感性和特异性，优势非常明显。本研究的结果不仅为老年哮喘的临床诊断提供了新的方法和思路，同时也为老年哮喘的后期治疗工作提供了实验依据。但由于本研究时间较短，研究样本量也较小，因而本研究的结果需要在将来的研究中得到进一步的验证。

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(本文编辑：王映红)

Value of serum miR-221 expression in the diagnosis of senile asthma

Wu Qiong, Liu Jinming

(Medical College of Tongji University, Shanghai 200331, China)

Objective To investigate the expression levels of serum miR-221 in senile patients with asthma and evaluate its potential value in the diagnosis of senile asthma.Methods One hundred and nine senile patients with asthma (the experimental group) and 115 healthy senile people (the control group) were recruited for the study. The expression levels of serum miR-221 of the 2 groups were detected by RT-PCR, and the receiver operating characteristic (ROC) curve was subsequently obtained. The concentrations of serum IL-4 and IL-12 of the 2 groups were measured by ELISA, and pulmonary function test (PFT) was performed as well. Finally, Spearman method was performed for correlation analysis between serum miR-221 expression levels and serum cytokine concentrations or PFT parameters.Results Compared with that of the healthy senile people, the expression levels of serum miR-221 in the senile patients with asthma were significantly elevated, and statistical significance could be seen, when comparisons were made between them(P<0.05). The diagnostic cutoff value of serum miR-221, confirmed by the ROC curve, was 1.37. There was statistical significance in IL-4 concentrations, IL-12 concentrations, FVC, FEV1 and PEF between the senile patients with asthma and healthy senile people(P<0.05). Spearman correlation analysis indicated that there was significant correlation between serum miR-221 expression levels and serum IL-4 concentrations, serum IL-12 concentrations, FVC, FEV1 or PEF(allP<0.05).Conclusion The expression level of serum miR-221 could be used as an indicator for the seriousness of senile asthma, and at the same time, it might open up a new avenue for clinical treatment of senile asthma.

Senile asthma; miR-221; IL-4; IL-12; Pulmonary function; Diagnosis

200331 上海，同济大学医学院(吴琼)；上海市肺科医院(刘锦铭)

刘锦铭，电子信箱：13761644303@163.com

R563.9

A [DOI] 10.3969/j.issn.1009-0754.2016.05.016

2016-01-28)