和颜坤泰胶囊对卵巢去势大鼠子宫形态及细胞凋亡的影响*

2016-11-28 13:11黄春丽张德芹张青霞文静

天津中医药 2016年11期

关键词：去势卵巢胶囊

黄春丽，张德芹，张青霞，文静

（天津中医药大学中医药研究院，天津300193）

·实验研究·

和颜坤泰胶囊对卵巢去势大鼠子宫形态及细胞凋亡的影响*

黄春丽，张德芹，张青霞，文静

（天津中医药大学中医药研究院，天津300193）

[目的]研究和颜坤泰胶囊对卵巢去势模型大鼠子宫形态及细胞凋亡的影响。[方法]以雌性去势大鼠为动物模型，分为空白对照组，假手术组，模型组，补佳乐组，莉芙敏组，和颜坤泰胶囊8、4、2 g生药/kg剂量组。给药8周后，观察药物对子宫病理学的影响，检测子宫细胞凋亡率及Bcl－2 mRNA、Bax mRNA和蛋白的表达。[结果]和颜坤泰胶囊可增加去势大鼠子宫横截面及壁厚，肌层面积及厚度，内膜面积及厚度，上皮厚度和腺体数（P＜0.01，P＜0.05）；能降低去势大鼠子宫细胞的凋亡率（P＜0.01，P＜0.05），升高子宫Bcl－2 mRNA和蛋白的表达（P＜0.01，P＜0.05），降低Bax mRNA和蛋白的表达（P＜0.01，P＜0.05）。[结论]和颜坤泰胶囊有一定的子宫营养作用，可通过调控Bcl－2和Bax基因与蛋白的表达来抑制子宫细胞的凋亡。

和颜坤泰胶囊；子宫形态学；细胞凋亡；Bcl－2 mRNA和蛋白；Bax mRNA和蛋白

更年期综合征（CLS）是指妇女在绝经前后由于卵巢功能衰退的内分泌变化所引起的各器官系统的综合证候群[1]，是女性特定阶段的常见病和多发病，严重影响了更年期妇女的生活质量[2]。中医药治疗更年期综合征在临床已开展多年[3－5]，除能显著地改善临床症状外，还有不良反应小的优势。目前用于研究更年期综合征动物模型较多，卵巢去势模型是其中一种较为经典的动物模型，通过摘除卵巢切断雌激素的来源造成雌激素低下的环境模拟更年期[6]，在围绝经期病症模型的研究中用途较广[7]。和颜坤泰胶囊由熟地黄、黄连、白芍、黄芩、阿胶、茯苓6味药物组成，功能滋阴清热、安神除烦，临床用于治疗更年期综合征取得了良好的效果[8－9]。张绍芬、段燕康等[10－11]已做了和颜坤泰胶囊对更年期大鼠的部分基础药效学研究，实验结果显示和颜坤泰胶囊可调节雌激素水平明显改善更年期各种症状，但其作用机制尚不明确。本课题组前期实验表明和颜坤泰胶囊可较明显的提高卵巢去势大鼠的子宫系数，本实验以卵巢去势大鼠为更年期模型，通过对去卵巢大鼠子宫形态及细胞凋亡的检测，从子宫细胞凋亡方面探讨和颜坤泰胶囊治疗更年期综合征的作用机制，以期为其临床应用提供更多实验依据。

1　材料与仪器

1.1动物雌性SD大鼠，体质量（200±20）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物合格证编号：SCXK（京）2002－0003。实验前1周饲养于天津中医药大学实验动物中心，自由饮食，温度18～22℃。

1.2药物和颜泰胶囊：贵阳新天药业股份有限公司产品，批号130107；莉芙敏：德国夏普天然药物制药公司产品，批号200801；补佳乐：DELPHARM LilleS.A.A生产，由拜耳医药保健有限公司广州分公司分包装，批号074A。

1.3试剂与仪器Trizol试剂（美国Invitrogen公司，批号66008）；anscriptorFirststrandcDNASynthesisKit（美国Applied Biosystems公司，批号10274023）；BR Green PCR Master Mix（美国Applied Biosystems公司，批号11226200）；引物合成（上海生工生物工程股份有限公司合成）；Tunel试剂盒（Roche in situ cell death detection kit cat，批号11684817910）；Bcl－2抗体（ABCAM公司，批号AB7973）；Bax抗体（ABCAM公司，批号AB7977）；二抗（DAKO公司，批号K5007）；DBA显色试剂盒（DAKO公司，批号K5007）。

ALLEGRA－64R高速离心机（美国Molecular Devices公司），PC－1000 PCR逆转录仪（美国PERKIN ELMER公司），CFX96型Real－Time PCR仪（美国Bio－Red公司），BMJ－1生物组织包埋机（天津航空机电公司），ASP300S全自动封闭脱水机（LEICA公司），RM2135病理切片机（LEICA公司）。见表1。

表1　PCR引物序列Tab.1　Sequences primers of PCR

2　方法

2.1模型的建立参照文献[12]卵巢去势大鼠造模方法，选择健康雌性SD大鼠64只，体质量（200±20）g，禁食12 h，以3.5%的水合氯醛腹腔注射麻醉，将大鼠俯卧置于固定台上，从背部最末肋骨下，在腋中线和距脊柱外侧约2 cm交叉处，剪除长毛，用安尔碘消毒后切开皮肤和背肌约1.5 cm，切口视野中可见一乳白色发亮的脂肪团，卵巢即包埋其中，用小镊子轻轻夹住脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，可见一团细线状不规则呈黄红色的卵巢，剪取时先将卵巢下输卵管（包括脂肪）用细线结扎，再摘除卵巢，术后顺势将子宫角送回腹腔中，用青霉素清洗创口，缝合肌肉及皮肤，同法摘除另侧卵巢。留取其中8只大鼠做假手术，方法同上，找出卵巢不摘除。大鼠术后连续3 d腹腔注射青霉素以防感染。术后第5天开始阴道涂片观察持续5 d，每日1次，呈现不规则动情周期的即为造模成功。

2.2分组及给药选择符合模型标准的大鼠48只，按随机数字表法分为6组，模型组，补佳乐组，莉芙敏组，和颜坤泰胶囊高、中、低剂量组，以及假手术组和正常组，每组8只。补佳乐组按0.2 mg/kg灌胃给予；莉芙敏组剂量为60 mg生药/kg；和颜坤泰胶囊高、中、低剂量组分别为：8、4、2g生药/kg；各组每日灌胃1次，连续8周，每次用药体积按每100g体质量灌胃1mL。模型组，假手术组及正常组灌胃等体积的蒸馏水。计算用药治疗期间各组大鼠每日均饲以普通饲料，自由进食、饮水，每周称质量1次。

2.3标本采集给药8周后，末次给药前禁食12 h，给药1 h后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，3 500 r/min，离心15 min，分离血清，分装冻存备用；迅速摘除子宫剥离周围脂肪组织，一半浸入10%福尔马林溶液，用于病理及免疫组化检测。一半冻存，用于RT-PCR检测。

2.4指标检测

2.4.1子宫病理的检测取出浸于福尔马林溶液中的固定好的子宫组织，通过改刀成所需大小，放入包埋盒内并做标记，放入全自动封闭脱水机脱水，二甲苯透明，在全自动包埋机上对组织进行石蜡包埋。包埋后的蜡块进行切片，石蜡切片厚度为4 μm，水浴锅中伸展，裱于干净载玻片上，62℃烤片3 h，二甲苯脱蜡10 min，苏木精-伊红（HE）染色，中性树胶封片。利用高倍倒置显微镜对所得病理片进行观察，拍照，用Image-Pru Plus 6.0软件进行统计。

2.4.2子宫细胞凋亡检测同上将固定好的子宫组织脱水，包埋，切片后脱蜡至水，用Tunel试剂盒测子宫细胞凋亡率，操作按说明进行，将子宫切片常规脱蜡至水，滴加末端标记酶及荧光抗体，DAB显色，苏木素复染，显微镜下检测细胞凋亡情况（细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即为凋亡细胞），采用Image-Pro Plus 6.0显微图像分析系统扫描后并分析结果，每张切片随机挑选3个视野，以阳性染色细胞百分比代表细胞凋亡率。

2.4.3子宫Bcl-2和Bax蛋白的检测切片脱蜡后置入乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修复缓冲液（pH8.0）的修复盒中进行抗原修复，放入3%过氧化氢溶液阻断内源性过氧化物酶，血清封闭，加一抗，4℃孵育过夜。加二抗，室温孵育50 min。DAB显色，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。苏木素复染细胞核，盐酸酒精分化，脱水，中性树胶封片。每个组织随机挑选3个高倍镜下视野进行拍照。应用Image-Pro Plus 6.0软件对每张照片进行分析得出每张照片阳性面积的比率（阳性面积/总面积）即为阳性面积百分比。

2.4.4子宫Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的检测采用RT-PCR法检测，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成序列见表1。取子宫组织，加入1 mL Trizol按说明提取RNA并检测其浓度与纯度，A260/ A280在1.8-2.0即可。按照Transcriptor First strand cDNASynthesis试剂盒说明书进行反转录，反应条件：25℃10 min，48℃30 min，95℃5min。聚合酶反应，其中逆转录产物0.5 μL，PCR主反应液12.5 μL，上下游引物1 μL，加无酶双蒸水至总反应体系25 μL，反应条件：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，40 cycles。以β-actin作为参照基因，用2-△△CT方法计算各基因的相对表达量。

2.5统计学方法实验结果用SPSS 18.0统计软件进行分析，结果以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3　结果

3.1和颜坤泰胶囊对去势大鼠子宫横截面积和厚度的影响给药8周后，与正常组相比，模型组大鼠子宫横截面积和子宫壁厚显著减小（P＜0.01）；与模型组相比，和颜坤泰胶囊低剂量组（2g/kg）子宫横截面积显著增加（P＜0.05），和颜泰胶囊中、低（4、2 g/kg）剂量组子宫壁厚显著增加（P＜0.05，P＜0.01）；补佳乐组子宫横截面积及子宫壁厚显著增加（P＜0.01）。结果见表2。

表2　和颜坤泰胶囊对卵巢去势大鼠子宫横截面和厚度的影响（±s）Tab.2　Effects of Heyan Kuntai capsules on cross-sectional area and thickness in uterus of ovariectomized rats（±s）