氨基酸生产菌代谢工程研究发展趋势

谢希贤 马 倩 陈 宁（天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

氨基酸生产菌代谢工程研究发展趋势

谢希贤 马 倩 陈 宁（天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

谢希贤，理学博士，天津科技大学生物工程学院教授，代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室副主任，中国氨基酸技术服务中心副秘书长，天津微生物学会理事。主要从事氨基酸和核苷酸代谢工程研究，高附加值氨基酸及衍生产品开发。

E-mail:xixianxie@tust.edu.cn

氨基酸及其衍生物具有重要的代谢与调控功能。随着代谢工程技术的迅速发展，代谢工程育种逐步取代传统的育种技术，在氨基酸生产菌株的选育中占据了主导地位，特别是在优良性状的选育，如菌株的低值原料利用能力、抗逆性等方面表现出越来越重要的作用。文章主要介绍氨基酸生产菌株的代谢工程育种技术及其发展趋势，以及代谢工程育种技术在菌株优良性状选育方面的应用。

氨基酸具有重要的代谢与调控功能，其不仅是诸多重要物质合成的必要前体物，同时可以调节关键代谢途径与过程，是人体生命活动所必需的物质，被广泛应用于食品、医药、化妆品、保健品、饲料等行业。目前，除大宗氨基酸品种（如L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸等）外，越来越多的小品种氨基酸、氨基酸衍生物等具有高附加值的产品得到开发1 2，品种已超过1000余种3。

我国是世界氨基酸生产大国，谷氨酸产量居世界首位，赖氨酸产量占全球产量的50%左右。但我国在新产品研发、菌株优良性状选育等方面，与世界氨基酸生产强国仍然存在较大差距。如何开发高效的遗传育种技术，实现优良性状氨基酸生产菌株的选育，是我国亟待解决的关键技术问题，也是提高我国在国

际氨基酸产业地位的关键。

1 代谢工程育种技术

传统的遗传育种方法，主要包括随机诱变、杂交、驯化等。这些方法可以获得数量丰富的突变株，但是菌株基因型的改变具有不定向性，获得的菌株鲁棒性通常较差，并且筛选过程耗时费力，这些缺陷严重制约着优良菌株的育种效率。随着DNA重组技术的不断发展，代谢工程育种技术在氨基酸生产菌株的选育过程中，表现出日益重要的作用，其优势在于可以更好地实现菌株的定点、定向选育45。按照策略的不同，代谢工程育种技术主要分为正向代谢工程、反向代谢工程、进化代谢工程3种类型（表1）。

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表1 代谢工程技术分类、基本策略及方法

1.1 正向代谢工程

正向代谢工程，主要涉及对基因转录、蛋白表达、代谢途径等过程的优化，包括限速酶的过表达、抑制基因的敲除、产物反馈抑制的解除、竞争代谢途径的阻断、转运系统的改造、合成代谢的优化、菌株对产物耐受力的提高、还原力的供应调节等4。Vogt等6通过敲除C.glutamicum中的转录调控因子LtbR、IolR，分别增强了L-亮氨酸的合成以及葡萄糖的摄取；通过削弱旁路代谢途径，增强了前体物质供应；同时，增强了乙酰羟酸合成酶的产物耐受性，最终获得了一株L-亮氨酸高产菌株。Bommareddy 等7通过改变C.glutamicum中3-磷酸甘油醛脱氢酶的辅酶特异性，构建了一条从头合成NADPH的途径，使得L-赖氨酸的产量提高了60%。这些研究表明，从代谢、合成、调控、辅酶平衡等多方面进行协同代谢工程改造，已成为菌株代谢工程选育的基本要求。基因组编辑技术的快速发展，特别是CRISPR8、NgAgo9等技术的出现，促进了多位点协同代谢工程改造的应用。目前，多途径协同代谢工程改造策略，已经被成功应用于L-赖氨酸7、L-亮氨酸6、L-异亮氨酸10、L-鸟氨酸1、L-精氨酸11、L-苯丙氨酸12、L-缬氨酸13等多种氨基酸高产菌株的选育。

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目前，正向代谢工程策略的研究重点，主要在提高改造过程效率、提高菌株代谢合成效率，以及开发更多高附加值产品等。Zhang等14首次在E.coli中构建了酮戊二酸的合成模块，发酵生产酮 戊二酸的产量达到40.8g/L。Jorge等15通过在一株腐胺生产菌C.glutamicum中异源表达E.coli中的腐胺转氨酶（PatA）与γ-氨基丁醛脱氢酶（PatD），获得了一株γ-氨基丁酸生产菌。后续又通过切断副产物形成途径与γ-氨基丁酸的代谢与利用途径等，使得γ-氨基丁酸的产量进一步提高了51%。Becker等16在C.glutamicum中构建了四氢嘧啶的合成模块ectABCD，四氢嘧啶产率达到6.7g/（L·d）。近期，Ning 等

2

在E.coli中构建了四氢嘧啶的合成途径，随后，通过进一步的代谢工程优化，包括阻断竞争代谢途径、启动子替换、反馈抑制解除等，最终获得25.1g/L的四氢嘧啶产量。可见，正向代谢工程技术，在高附加值新产品的开发过程中，具有定点设计、定向性强、效果直接等优势。

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1.2 反向代谢工程

生物体内代谢网络错综复杂，人们对生物体内遗传背景、代谢调控等的认识仍十分欠缺，传统的正向代谢工程策略，在很多微生物的改造中未能取得预期效果。于是，Bailey等17首次提出一种逆向的代谢工程策略，即“反向代谢工程”（inverse metabolic engineering），其研究思路为：首先，识别或构建出目的表型；然后，鉴定出此目的表型的决定基因或突变位点；最后，将相应的基因性状转移到其他菌株中。近年来，随着系统生物学、代谢模拟、代谢通量分析等辅助技术的快速发展，反向代谢工程技术在氨基酸优良生产菌株的选育中表现出越来越重要的作用。

在已有氨基酸高产菌株基础上，通过比较高产菌株与原始菌株的基因组、转录组、蛋白组、代谢组，或者通量组的差异，确定菌株高产性状的决定基因或突变位点，最后在目的菌株中优化这些关键基因，以实现菌株性能的进一步提高。Ikeda18、Ohnishi19等分别通过基因组比较的方法，从原始菌株出发，构建了L-赖氨酸的高效生产菌株。Ikeda等20通过比较3株L-精氨酸/L-瓜氨酸生产菌的基因组信息，确定了若干关键基因的突变位点，从原始菌株出发重新构建了一株L-精氨酸/L-瓜氨酸生产菌。Sindelar等21采用DNA芯片技术，对赖氨酸生产菌株MH20-22B以及其他几株C.glutamicum进行了转录组比较分析，发现NCg10855、amtA-ocd-soxA操纵子对赖氨酸生产有重要的作用，通过对其进行过表达，使赖氨酸产量提高了40%。Kiefer等22通过比较L-赖氨酸生产菌C.glutamicum分别以葡萄糖、果糖为碳源的代谢通量差异，获得了提高其以果糖为碳源合成L-赖氨酸的代谢工程改造策略。

转录表达干扰，是反向代谢工程的另一种策略。Cleto等23基于现在十分火热的CRISPR/Cas9技术，对C.glutamicum进行了DNA转录干扰。他们利用失去核酸酶活性的dCas9蛋白，与相应DNA位点的结合，降低了C.glutamicum中pgi、pck、pyk基因的表达，从而使得L-赖氨酸与L-谷氨酸的产量较上述基因的敲除菌有了很大提高。实验表明，CRISPR干扰是一种快速高效的代谢工程策略，避免了基因敲除与后续的菌株筛选工作。

1.3 进化代谢工程

尽管人们可以采取多种方法对微生物进行代谢工程改造，但不能否认微生物进化本身的强大力量，在进化过程中，微生物更倾向于生长与生存，并不总是按照人类的意愿去进行目的产品合成24。于是，人们将适应性进化策略引入到微生物代谢工程改造中，特别是适应性进化策略与生物传感器25，以及荧光激活细胞分离技术（fluorescence activated cell sorting，FACS）的结合，促进了微生物进化代谢工程改造的发展24 26。

生物传感器主要有3种类型25：福斯特能量共振转移生物传感器、基于转录调控因子的生物传感器，以及核糖开关。目前，在微生物的进化代谢工程中应用较多的主要为后两种类型。两种氨基酸响应的转录调控因子Lrp与LysG已被成功应用于C.glutamicum中生物传感器的构建27。Mustafi等28 29将基于Lrp的生物传感器应用于分支链氨基酸、L-甲硫氨酸高产菌株的进化代谢工程选育。Mahr等26将基于转录调控因子Lrp的生物传感器引入L-缬氨酸生产菌C.glutamicum ΔaceE中，并进行了适应性实验室进化，最终使得L-缬氨酸的产量提高了25%。目前已发现的核糖开关有20多种30，其中仅有两种氨基酸核糖开关，即赖氨酸核糖开关与甘氨酸核糖开关。Zhou等31尝试分别将E.coli与B.subtilis中的核糖开关引入赖氨酸生产菌C.glutamicum中，通过控制柠檬酸合成酶gltA的表达，继而影响TCA循环的代谢通量，最终，两种策略分别使L-赖氨酸的产量提高了63%与38%。相信随着更多转录调控因子与核糖开关的发现，以及更多新技术的开发，进化代谢工程技术将会在氨基酸生产菌株的选育方面发挥更大的作用。

2 氨基酸生产菌优良性状开发

随着氨基酸产业链的不断延伸，氨基酸产品由大宗的谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸等，逐步拓展到一些小品种氨基酸以及氨基酸衍生物等。这些不同品种氨基酸在生产过程中，都面临着原料成本较高、菌株抗逆性较差等问题。如何运用高效的代谢工程育种技术，选育具有低值原料利用、强抗逆性等优良性状的氨基酸生产菌株，将产生非常重要的应用价值，是氨基酸生产企业间竞争的关键。

2.1 低值化原料利用

日益加剧的全球粮食危机，对氨基酸发酵生产中原料的选用提出了更高的要求。如何利用低值化原料（如来源于农业废料的木质纤维素水解液）取代传统的淀粉糖发酵是当前的研究热点。木质纤维素水解液中含有丰富的五碳糖，木糖与阿拉伯糖的含量可分别达到20%和5%。然而，大多数微生物的最佳碳源为六碳糖，而非五碳糖。若能构建高效利用五碳糖的氨基酸生产菌株，将有效缓解粮食危机的紧张局势。

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目前，许多研究者构建了能利用五碳糖的氨基酸生产菌株，然而利用效率并不高。为了提高木糖的利用率，Meiswinkel 等32尝试将不同来源的木糖异构酶在C.glutamicum中进行异源表达，发现来源于野生黄单胞菌的木糖异构酶具有最佳的木糖利用效果。后续进一步优化了木酮糖激酶，最终发现野生黄单胞菌来源的木糖异构酶与C.glutamicum来源的木酮糖激酶可以产生最佳的木糖利用效果。

构建五碳糖、六碳糖共利用的氨基酸生产菌株，相对于单一五碳糖利用菌株的构建，是一种较易实现的策略。以构建共利用葡萄糖与木糖的C.glutamicum为例，其技术难点主要集中在木糖的转运与代谢两方面。一方面，可以采用适应性进化代谢工程策略，进行混合糖培养基驯化，同时，构建、增强木糖转运蛋白表达，以增强C.glutamicum中的木糖转运。另一方面，可以通过协调木糖异构酶XI与木酮糖激酶XK，实现木糖的快速代谢。

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2.2 抗逆性

发酵菌体的抗逆性，指菌体对各种不利环境因素的抵抗能力，如耐酸、耐热、耐渗透压等。通过代谢工程技术，使生产菌株获得抗逆性状，可以减少发酵过程中染菌的几率，降低发酵过程的复杂程度，利于积累高浓度产物等。

微生物体内的耐酸机制，主要包括谷氨酸脱羧系统、精氨酸脱氨系统、质子泵外排、DNA/蛋白修复、生物膜形成等33。相应地，菌株耐酸性提高的方法，主要包括对谷氨酸脱羧酶、精氨酸脱亚氨酶等的过表达，以及运用适应性进化策略，筛选耐酸表型。

微生物体内耐热的机制，主要包括热激蛋白表达上调、DNA/蛋白修复增强、细胞膜/细胞壁改变、物质转运能力降低等。引入嗜热菌小热激蛋白、合成细胞保护物质，或者适应性进化策略的运用是强化菌株耐热能力的基本思路。

微生物耐渗透压能力的提高，可以通过适应性进化、增强相容性物质合成、发酵过程中添加相容性物质（如甜菜碱）等策略实现。此外，可以通过对发酵过程的工艺控制，如细胞循环发酵，减轻环境渗透压对菌株的压力。

在这些抗逆性状的获得过程中，适应性进化代谢工程策略可以发挥其优势，利用微生物强大的生存能力，进行适应性进化，同时结合其他代谢工程技术手段，通过筛选获得具有抵抗不利环境刺激的高产菌株。这些优良性状的获得，将提高菌株在工业生产中的鲁棒性，降低对工艺控制过程的要求，提高生产效益。

3 展 望

当前，我国氨基酸产业处于机遇与挑战并存的局势，开发高效的代谢工程菌、开发新产品、提升产品质量、优良性状菌株的选育，是氨基酸行业发展与竞争的关键。随着我国合成生物技术、系统生物技术、代谢工程技术的快速发展，我国在氨基酸的代谢工程育种方面取得了巨大进步，并且仍具有较强的发展潜力。相信随着我国技术研发能力的提高，我国氨基酸产业必将赶超国际先进水平。

10.3969/j.issn.1674-0319.2016.04.005