高效液相色谱法测定土壤中2，4-二羟基苯甲酸含量

和春庭，张育梅，及 利，杨立学*

(1.云南省怒江傈僳族自治州林业局，怒江 673100；2.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040)



高效液相色谱法测定土壤中2，4-二羟基苯甲酸含量

和春庭1，张育梅1，及 利2，杨立学2*

(1.云南省怒江傈僳族自治州林业局，怒江 673100；2.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040)

建立高效液相色谱法(HPLC)测定土壤中2，4-二羟基苯甲酸含量，分析4种不同土地利用方式土壤中2，4-二羟基苯甲酸的垂直分布趋势。通过用乙酸乙酯水浴24 h提取2，4-二羟基苯甲酸，蒸干并溶解于色谱级甲醇中。以流动相为3%冰醋酸和甲醇(75：25)对样品进行洗脱，流速1 mL/min，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，检测波长280 nm，柱温25℃。结果表明：2，4-二羟基苯甲酸进样浓度在80～800 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程为Y=13.315X-12.803(r2=0.999 9)；2，4-二羟基苯甲酸的重复性、精密度和稳定性，相对标准偏差(RSD)结果分别为0.778%、1.623%和1.918%，平均加样回收率为97.675%，RSD结果为0.771%(n=6)，均达到定性和定量分析的要求。应用高效液相色谱法测定2，4-二羟基苯甲酸含量操作简便、快速、准确，天然次生林土壤中的2，4-二羟基苯甲酸含量大于其余3种土地利用方式的，且4种土地利用方式皆表现出随着土层深度的增加，2，4-二羟基苯甲酸含量降低的趋势。

高效液相色谱法；2，4-二羟基苯甲酸；土地利用方式

0 引 言

人类不同的生产、生活目的决定着土壤的不同利用方式[1]，而土地利用方式对土壤结构、养分和微生物都有至关重要的影响[2-7]。在不同土地利用方式转变过程中伴随着酚酸物质的积累，同时，由于不同土地利用方式条件下，地上植被的组成和类型不同以及土壤微生物对地表凋落物的分解作用，造成了不同土地利用方式土壤中酚酸物质的差异。国内外众多学者研究表明，酚酸物质与微生物关系密切[8-13]。2，4-二羟基苯甲酸是一种典型的植物次生代谢物质，苏金豹等通过室内盆栽试验向土壤中添加2，4-二羟基苯甲酸等物质，发现酚酸物质对植物菌根侵染率和根系活力有显著影响[14]。高效液相色谱法(HPLC)具有操作简便、快速、准确等优点，本研究采用HPLC测定土壤中2，4-二羟基苯甲酸含量，通过重复性、精密度、稳定性和回收率等指标的评价，为该物质在土壤中的含量测定提供依据。

1 仪器、试剂与土壤样品

(1)仪器。高效液相色谱仪(型号Agilent 1200)、电子天枰(型号AE240)、冷冻干燥机(型号FD-1A-50)和旋转蒸发器(型号RE-52)。

(2)试剂。2，4-二羟基苯甲酸对照品(上海晶纯试剂有限公司，归一化法计算其纯度≥98%)、甲醇，色谱纯(美国Dikma公司)。

(3)样品：土壤样品于2014年7月采集于黑龙江省五常市山河屯林业局奋斗林场，分为天然次生林、落叶松人工林、玉米农田地和撂荒地等4种不同土地利用方式。

2 色谱条件

流动相：3%冰醋酸∶甲醇=75∶25，流速：1 mL/min，检测时间：15 min。色谱柱：Agilent ZORBAXSB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，检测波长：280 nm，柱温：25℃。在上述条件下，2，4-二羟基苯甲酸与样品中其他色谱峰基本达到基线分离。2，4-二羟基苯甲酸的保留时间约为5.406 min，如图1所示。

图1 2，4-二羟基苯甲酸的保留时间Fig.1.Retention time of 2，4-dihydroxy benzoic acid

3 分析方法与结果

3.1 溶液的制备

(1)对照品溶液的制备。用天平精密称取100 mg的2，4-二羟基苯甲酸对照品移入50 mL容量瓶中，加色谱级甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(每1 mL含2，4-二羟基苯甲酸2 mg)。

(2)样品溶液的制备。将取回的土壤样品冻干，用天平称量10 g土移入250 mL圆底烧瓶中，加入50 mL乙酸乙酯，在90℃条件下连续水浴12 h，然后取出圆底烧瓶待冷却后滤出乙酸乙酯与另一圆底烧瓶，重复上述步骤两次，将混合后的乙酸乙酯在40℃的水温中旋干蒸发，直至瓶底形成一层薄膜，瓶壁无液体成股流下，再加5 mL蒸馏水溶解，用2 mol/L HCl调节pH至2.0。量取50 mL乙酸乙酯倒入125 mL分液漏斗，再将上述溶液倒入分液漏斗进行萃取，将得到的乙酸乙酯再次浓缩至干，加入2 mL色谱级甲醇，反复摇匀溶解薄膜，再用5 mL针筒吸出后经0.45 μm微孔滤膜过滤，得到样品溶液，并装入进样瓶。

3.2 标准曲线的制备

向25 mL容量瓶中分别加入1、2、4、6、8和10 mL的2，4-二羟基苯甲酸对照品贮备液，定容，得到浓度分别为80、160、320、480、640、800 μg/mL的对照品溶液(峰面积分别为1 068.536、2 132.92、4 195.824、6 369.36、8 549.248、10 628.336mAU)，充分摇匀后，经0.45 μm微孔滤膜过滤后分别装入进样瓶中备用。调整进样器进样量10 μL注入色谱仪，得进样量X(μg/mL)与峰面积Y的线性方程(图2)。结果表明，2，4-二羟基苯甲酸进样量在80～800 μg/mL与峰面积成良好的线性关系，回归方程为Y=13.315X-12.803，r2=0.999 9(n=6)。

3.3 重复性试验

配制浓度为160 μg/mL 2，4-二羟基苯甲酸对照品溶液，调整进样器进样量10 μL，重复进样5次，测得色谱峰的峰面积平均值为2 125.667mAU，RSD为0.778%，表明重复性良好，符合分析要求(表1)。

3.4 精密度试验

精密称取天然次生林0～5 cm层林地土样品6份，按样品测定法重复测定6次，测得2，4-二羟基苯甲酸含量的平均值为43.947 μg/g，RSD 为1.623%，显示精密度良好，符合分析要求(表2)。

图2 2，4-二羟基苯甲酸的HPLC进样量 与峰面积之间的标准曲线Fig.2 Standard curves between the HPLC sample quantity and peak area of 2，4-dihydroxy benzoic acid

次 数峰面积/mAU峰面积均值/mAURSD/%12137.07222132.92032097.91242123.12052137.3122125.6670.778

表2 天然次生林0-5 cm土壤的2，4-二羟基 苯甲酸含量(n=6)Tab.2 2，4-dihydroxy benzoic acid content in 0-5 cm layer depth of natural secondary forest (n=6)

3.5 稳定性试验

取天然次生林林地土样品溶液，分别在0、2、4、8、16、24 h测定2，4-二羟基苯甲酸峰面积，计算峰面积的RSD为1.918%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

3.6 准确度实验(加样回收试验)

分别精密称取6份天然次生林林地土样品10 g，精密加入160 μg 2，4-二羟基苯甲酸对照品，按样品溶液制备及测定方法操作，进行高效液相色谱分析，其平均回收率为97.675%，RSD为0.771%，符合分析要求(表3)。

表3 回收率实验结果(n=6)Tab.3 Experimental results of the recovery rate(n=6)

3.7 样品测定

分别准确称取天然次生林、落叶松人工林、玉米农田地和撂荒地土壤样品和2，4-二羟基苯甲酸对照品溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪，测定色谱峰峰面积，计算含量(表4)。

4 讨 论

4.1 不同溶剂的选择

由于2，4-二羟基苯甲酸微溶于水，选择色谱级甲醇作为样品溶解剂，样品溶解时最好超声处理，以缩短溶解时间。

4.2 流动相的选择

不同于其他文献[15-19]，根据2，4-二羟基苯甲酸的性质，本研究流动相中的水相选用加入刺激性气味较小的酸性成分冰醋酸，作为离子抑制剂或反相离子对试剂有抑制样品组分的解离，有改善峰形的作用。经过预实验考察，1%的冰醋酸拖尾明显，2%冰醋酸的峰形与3%冰醋酸的相当，但采用3%冰醋酸水溶液的pH适合本研究所采用色谱柱的pH范围，稳定了流动相的pH。此故选择甲醇作为有机相，3%冰醋酸作为水相。以流动相3%冰醋酸∶甲醇=75∶25、65∶35、55∶45分别测定2，4-二羟基苯甲酸对照品的峰值，发现流动相3%冰醋酸∶甲醇=75∶25的峰形较好，无明显拖尾现象。

表4 不同土地利用方式土壤各土层中 2，4-二羟基苯甲酸的含量Tab.4 2，4-dihydroxy benzoic acid content in different soil layer in varies land uses

4.3 检测波长的选择

选用Waters二级管阵列检测器进行检测波长，发现检测波长为280 nm时，分离度较好，2，4-二羟基苯甲酸有最大吸收，且基线较平稳，峰形适宜，灵敏度高，无其他杂质峰干扰。

5 结 论

采用HPLC法测定了4种不同土地利用方式土壤中的2，4-二羟基苯甲酸含量，试验优化反复对比多次后发现，采用3%冰醋酸∶甲醇=75∶25的流动相体系能使标准品与其他杂质得到有效分离，且提取和测定过程中步骤简便、省时，出峰时间适宜。该方法的线性范围、精密度、准确度和回收率都能满足4种不同土地利用方式土壤中2，4-二羟基苯甲酸的定性和定量分析要求。研究还发现，天然次生林的2，4-二羟基苯甲酸含量大于其余3种土地利用方式的，且4种土地利用方式皆表现出随土层深度增加2，4-二羟基苯甲酸含量降低的趋势。

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Determination of 2，4-dihydroxy Benzoic AcidConcentration of Soil Using HPLC Method

He Chunting1，Zhang Yumei1，Ji Li2，Yang Lixue2*

(1.Nujiang Lisu Autonomous Prefecture，Yunnan province，Forestry Bureau，Nujiang 673100；2.Northeast Forestry University，College of Forestry，Harbin 150040)

The concentration of 2，4-dihydroxy benzoic acid was determined based on the established High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method and the amount of 2，4-dihydroxy benzoic acid was analyzed in 4 different land uses in the vertical distribution.The 2，4-dihydroxy benzoic acid in sample was extracted by 24 hours-water-bath heating with ethyl acetate，and then was evaporated and dissolved in chromatographic grade methanol.The sample elution was taken by the mobile phase which was composed of 3% glacial acetic acid and methanol (75∶25) with the flowing rate of 1 mL/min.The chromatographic column was Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm) while the detecting wavelength was 280 nm and the column temperature was 25℃.The result showed that a good linear relationship existed between the concentration of 2，4-dihydroxy benzoic acid and the peak area in the range of 80～800 μg/mL.The obtained linear regression equation wasY=13.315X-12.803 (r2=0.999 9).The relative standard deviation (RSD) of repeatability，precision and stability of 2，4-dihydroxy benzoic acid were 0.778%，1.623% and 1.918% respectively.The average recovery rate was 97.675% and the RSD was 0.771% (n=6)，all of which met the requirements of qualitative and quantitative analysis.The determination of 2，4-dihydroxy benzoic acid content using HPLC method was simple，rapid and accurate.The amount of the 2，4-dihydroxy benzoic acid in soil of natural secondary forest was found the greatest among 4 kinds of land.A uses and the concentration of 2，4-dihydroxy benzoic acid decreased with the depth of the soil.

HPLC；2，4-dihydroxy benzoic acid；Land uses

2016-06-06

中央高校基本科研业务费专项资金(2572016EAJ1)；国家自然科学基金(31170583)

和春庭，高级工程师。研究方向：森林培育，森林生态学。

*通信作者：杨立学，博士，教授。研究方向：种苗生理生态、林木间的化感作用、人工林定向培育。E-mail：ylx_0813@163.com

和春庭，张育梅，及 利，等.高效液相色谱法测定土壤中2，4-二羟基苯甲酸含量[J].森林工程，2016，32(6)：34-37.

TS 47；O 657.72

A

1001-005X(2016)06-0034-04