CCL2、CCL21在慢性扁桃体炎患者扁桃体中的表达和意义*

张 园， 许霞青， 刘胜洪， 崔永华， 王志斌 △

1华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科，武汉 4300302华中科技大学同济医学院基础医学院解剖学系，武汉 430030



论 著

CCL2、CCL21在慢性扁桃体炎患者扁桃体中的表达和意义*

张 园1， 许霞青2， 刘胜洪2， 崔永华1， 王志斌1 △

1华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科，武汉 4300302华中科技大学同济医学院基础医学院解剖学系，武汉 430030

目的 探讨单核细胞趋化蛋白CCL2、次级淋巴组织趋化因子CCL21、T淋巴细胞表面标志CD3、B淋巴细胞表面标志CD20在慢性扁桃体炎(chronic tonsillitis，CT)患者和特发性扁桃体肥大(idiopathic tonsillar hypertrophy，ITH)患者扁桃体中的表达和意义。方法 应用免疫组织化学、Western blot技术分析两组患者扁桃体CCL2、CCL21、CD3、CD20的表达。结果 免疫组织化学检测显示CT组扁桃体CCL21、CD3、CD20的表达较ITH组高，而CCL2的表达较ITH组低，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。Western blot检测显示CT组和ITH组扁桃体CCL2、CCL21、CD3、CD20的表达分别为：(0.35±0.11)vs.(0.67±0.18)，(0.78±0.23)vs.(0.39±0.16)，(2.28±0.54)vs.(1.27±0.39)，(1.34±0.23)vs.(0.83±0.24)，差异有统计学意义(均P<0.05)。结论 在CT患者扁桃体中，CCL2可能通过抑制淋巴细胞归巢发挥了抗炎作用，CCL21可能通过促进淋巴细胞归巢发挥了促炎作用。

慢性扁桃体炎； 淋巴细胞； 趋化因子

慢性扁桃体炎(chronic tonsillitis，CT)以反复发热、咽痛感染症状为特征，可导致远处器官的免疫损伤，如IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)。趋化因子在疾病的发展过程中发挥了重要作用[1-3]。特发性扁桃体肥大(idiopathic tonsillar hypertrophy，ITH)以儿童扁桃体体积增大，阻塞性睡眠呼吸暂停为特征，无感染史。

淋巴细胞归巢(lymphocyte homing)是淋巴细胞迁移的一种特殊形式，正常状态下淋巴细胞从外周血液进入扁桃体组织，T淋巴细胞主要停留于淋巴滤泡间区，B淋巴细胞主要停留于淋巴滤泡区，监视进入扁桃体的外来抗原，参与炎症反应。

我们以往研究显示CT伴IgAN扁桃体T、B淋巴细胞数量较CT扁桃体增多，粘附分子、血管地址素在淋巴细胞归巢中发挥了重要作用[4-5]。研究显示淋巴细胞归巢还受趋化因子等因素调控，趋化因子参与淋巴细胞归巢调节包含抑制或促进两方面作用，单核细胞趋化蛋白CCL2、次级淋巴组织趋化因子CCL21均为CC类趋化因子，可对T、B淋巴细胞产生趋化性[6-7]。本文旨在观察CCL2、CCL21和T、B淋巴细胞表面标志CD3、CD20在CT扁桃体和ITH扁桃体中的表达，探讨趋化因子在慢性扁桃体炎中的作用及其与淋巴细胞归巢的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

所有患者均于2012年4月至2012年12月间在华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科接受扁桃体切除术，CT组25例，男女比例为13∶12，年龄6～29岁，平均年龄(15.6±7.3)岁，患者反复发作急性扁桃体炎，每年发作至少3～4次，病程至少1年，体格检查双侧腭舌弓明显慢性充血，挤压腭舌弓，可自扁桃体隐窝口流出脓性分泌物；ITH组25例，男女比例为15∶10，年龄3～10岁，平均年龄(6.2±1.6)岁，患者增大的扁桃体导致阻塞性的睡眠呼吸暂停、咽下困难，但无扁桃体感染史，体格检查双侧扁桃体、腭舌弓淡红，扁桃体光滑，隐窝口形态正常。两组患者均无IgA肾病、风湿性关节炎、长期低热、心肌炎等并发症。免疫组化研究CT组与ITH组各25例，Western blot研究分别从各组中随机挑取8例。

1.2 扁桃体标本处理

所有患者均于全麻下行双侧腭扁桃体切除术，无菌条件下收集双侧扁桃体，灭菌生理盐水漂洗干净后，右侧扁桃体样本甲醛固定，石蜡包埋切片，左侧扁桃体样本冻存于-80 ℃。

1.3 主要试剂

兔抗人多克隆抗体CCL2、CCL21，购于北京博奥森公司；鼠抗人多克隆抗体CD3、CD20，购于北京中杉公司；生物素标记羊抗鼠单克隆抗体IgG及羊抗兔单克隆抗体IgG均购于上海越研生物科技有限公司；链霉亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物购于美国Sigma公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购于武汉飞羿科技有限公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG购于武汉博能实验用品经营部。

1.4 实验方法

1.4.2 Western blot分析 每例患者取一定量的扁桃体组织，浸泡于适量的组织蛋白裂解液，置于冰上，并将组织剪碎，在碎冰上电动匀浆，12 000 r/min 3 min。置于4℃，静置30 min，超声粉碎3 min，低温离心12 000 r/min 15 min，取上清液-80 ℃保存，待用。

取上述匀浆的上清液于10% SDS-PAGE电泳后，蛋白湿转入硝酸纤维素膜上，后经① 5%牛奶封闭，CCL21、CCL2封闭75 min，CD20、CD3封闭45 min；②一抗CCL21、CCL2(1∶1 000)，CD20、CD3(1∶300)室温孵育3 h，再放4℃孵育过夜，取出后室温孵育10 h，0.02 mol/L TBST(pH7.4)洗膜3次，每次10 min；③辣根过氧化物酶标记的羊抗兔及羊抗鼠IgG(1∶2 000)，置于室温孵育2 h，0.02 mol/L TBST(pH 7.4)清洗膜3次，每次10 min；④ECL显色曝光。用Image2 pro plus 5.1软件对Western blot结果目的条带进行灰度分析，并用其与对应泳道β-actin灰度的比值作为蛋白表达相对含量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 免疫组化检测

CCL2表达于淋巴滤泡及淋巴滤泡间区，ITH组表达水平较高(图1、2)。CCL21主要表达于淋巴滤泡间区，淋巴滤泡内表达量较淋巴滤泡间区少，CT组表达水平较高(图1、3)。CD3主要表达于淋巴滤泡间区，CT组扁桃体表达水平较高(图1、4)。CD20主要表达于淋巴滤泡内，CT组扁桃体表达水平较高(图1、5)。表1为免疫组化分析结果，经统计学处理，显示差异均具有统计学意义。

A：CCL2；B：CCL21；C：CD3；D：CD20图1 CCL2、CCL21、CD3、CD20在淋巴滤泡和淋巴滤泡间区的分布(SABC染色，×100)Fig.1 Distribution of CCL2，CCL21，CD3 and CD20 in the lymphoid follicle and interfollicular area(SABC staining，×100)

A：CT组；B：ITH组图2 两组扁桃体组织中CCL2的表达(SABC染色，×400)Fig.2 Expression of CCL2 in the tonsillar tissues in the two groups(SABC staining，×400)

A：CT组；B：ITH组图3 两组扁桃体组织中CCL21的表达(SABC染色，×400)Fig.3 Expression of CCL21 in the tonsillar tissues in the two groups(SABC staining，×400)

A：CT组；B：ITH组图4 两组扁桃体组织中CD3的表达(SABC染色，×400)Fig.4 Expression of CD3 in the tonsillar tissues in the two groups(SABC staining，×400)

A：CT组；B：ITH组图5 两组扁桃体组织中CD20的表达(SABC染色，×400)Fig.5 Expression of CD20 in the tonsillar tissues in the two groups(SABC staining，×400)

细胞因子组别+χ2PCCL2CT10 12 3ITH1 121212760002CCL21CT1 618ITH99711840003CD3CT21013ITH101058890012CD20CT2 716ITH911511110004

2.2 Western blot检测

CCL2、CCL21、CD3、CD20各条带分别显示在分子量10、15、16～28、33～37 kD处，CT组和ITH组扁桃体CCL2、CCL21、CD3、CD20的相对表达量检测数据分别为：(0.35±0.11)vs.(0.67±0.18)，(0.78±0.23)vs.(0.39±0.16)，(2.28±0.54)vs.(1.27±0.39)，(1.34±0.23)vs.(0.83±0.24)，两组之间差异均具有统计学意义(均P<0.05)，即ITH组CCL2与β-actin的灰度比值较CT组高，CT组CCL21、CD3、CD20与β-actin的灰度比值较ITH组高(图6)。

*P<0.05图6 Western blot检测CCL2、CCL21、CD3、CD20在CT组和ITH组扁桃体中的表达Fig.6 Western blot analysis of the expression of CCL2，CCL21，CD3 and CD20 in the tonsillar tissues in CT and ITH groups

3 讨论

扁桃体肥大引起阻塞症状是年龄较小的患儿行扁桃体切除术的主要原因，随着年龄的增大感染变成主要指征[8]，即使在没有感染史的肥大扁桃体中，组织学上也可以看到慢性炎症的表现[9]，因为细菌抗原的持续刺激，感染后的扁桃体较无感染的扁桃体表现出更严重的炎症反应[10]。本文采用年龄较小患儿的肥大扁桃体作为炎症扁桃体的对照，有助于观察炎症扁桃体中淋巴细胞数量的变化。

淋巴细胞浸润扁桃体组织是扁桃体炎症的一个重要过程，CD3为T细胞膜上的重要分化抗原，是成熟T细胞的特征性标志。Lopez-Gonzalez等[11]的研究结果显示CT扁桃体中CD3+T淋巴细胞的含量显著高于ITH扁桃体。CD20表达于早期B细胞和成熟B细胞阶段，调节B细胞增生和分化。Semberova等[10]的研究结果显示CT扁桃体中CD20+B淋巴细胞的含量高于ITH扁桃体。我们早期的研究显示CT伴IgAN扁桃体与单纯CT扁桃体相比CD3+T淋巴细胞数量显著增多，而CD20+B淋巴细胞数量没有显著区别[4]，本研究中CT扁桃体中CD3+T淋巴细胞、CD20+B淋巴细胞的含量显著高于ITH扁桃体。我们对扁桃体趋化因子表达的研究则有助于阐释CT扁桃体与ITH扁桃体淋巴细胞数量差异的相关机制。

趋化因子是一类促炎细胞因子，可以吸引、激活特殊类型的白细胞。Frade等[7，12]研究发现CCR2表达于扁桃体激活的T淋巴细胞和B淋巴细胞，CCL2与CCR2结合，可对扁桃体T淋巴细胞和B淋巴细胞产生趋化性。最初CCL2和CCR2被认为具有促进炎症的作用，因为CCL2和CCR2的缺失或被抑制，可以减弱哮喘和类风湿关节炎的炎症和免疫反应[13-14]。然而CCL2在哮喘和类风湿关节炎中的免疫调节作用可能比最初的认识更复杂，即CCL2也具有抗炎作用。缺乏CCL2或CCR2的老鼠可发生哮喘[15]。另外，有哮喘的孩子与无哮喘的孩子相比，血清中CCL2的水平降低[16]。CCR2在类风湿关节炎中也有保护作用，因为在CCR2缺乏的老鼠中，胶原诱导的关节炎表现出更严重的炎症反应，如激活的T和B淋巴细胞数量增加[17]。本研究显示CT扁桃体CCL2的表达量明显低于ITH扁桃体，提示CCL2在扁桃体慢性炎症过程中可能发挥了抗炎作用。

CCL21具有趋化淋巴细胞到次级淋巴组织器官和炎症部位的特性，可以介导炎症的发生，参与免疫应答[18-19]。CCL21是幼稚T淋巴细胞的高效趋化因子，它主要表达于淋巴组织的T细胞聚集区，CCL21通过与β2整合素(LFA1)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)结合介导幼稚T淋巴细胞与高内皮小静脉(high endothelial venules，HEV)的牢固粘附，这是淋巴细胞归巢重要的一步[20]。有研究证明CCL21也能趋化B淋巴细胞[6]，像T淋巴细胞一样，B淋巴细胞通过HEV进入淋巴组织，在进入淋巴滤泡之前首先聚集在CCL21表达的T细胞区域[21]，然后在B淋巴细胞趋化因子如BLR1的吸引下，进入淋巴滤泡[22]。本研究显示CT扁桃体CCL21表达量明显低于IHT扁桃体，说明了CCL21在扁桃体慢性炎症过程中可能发挥了促炎作用。

CCL2和CCR2结合可以抑制B淋巴细胞向外周淋巴组织归巢，Flaishon等[23]的研究显示未成熟的B淋巴细胞表达CCR2受体，同时分泌CCL2。CCR2缺乏的未成熟B淋巴细胞表现出对CXCL12增强的刺激反应，如细胞骨架重排和迁移，向淋巴结归巢。CCL2也可以通过抑制CCL21诱导的LFA-1/ICAM-1对淋巴细胞的粘附作用，减弱淋巴细胞对趋化因子的趋化性而发挥抗炎作用[24]。CCL21主要表达于淋巴滤泡间区即T细胞富集区域，同时在淋巴滤泡内也有较少表达，CD3主要表达于淋巴滤泡间区，CD20主要表达于淋巴滤泡区，且它们在CT扁桃体中的表达水平均较ITH患者高，提示了在扁桃体慢性炎症过程中CCL21可能通过促进T、B淋巴细胞向扁桃体归巢而发挥促炎作用，而CCL2可能通过抑制CCL21介导的淋巴细胞归巢或自身抑制B淋巴细胞归巢而发挥抗炎作用。

有研究显示心肌梗死后抗CCL21抗体可以减小心肌梗死面积，提高心肌的重塑性[25]，那么未来是否可用抗CCL21抗体或CCL2抗体控制扁桃体炎发作，有待进一步研究。

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(2016-06-21 收稿)

Expression of CCL2 and CCL21 in the Tonsillar Tissues of Patients with Chronic Tonsillitis

Zhang Yuan1，Xu Xiaqing2，Liu Shenghong2et al

1Department of Otolaryngology & Head and Neck Surgery，Tongji Hospital，Tongji MedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofAnatomy，SchoolofBasicMedicalSciences，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To investigate the expression of monocyte chemoattractant protein CCL2，secondary lymphoid-tissue chemokine CCL21，T lymphocyte surface marker CD3，and B lymphocyte surface marker CD20 in the tonsillar tissues of patients with chronic tonsillitis(CT)and idiopathic tonsillar hypertrophy(ITH).Methods Immunohistochemistry and Western blotting were used to analyze the expression of CCL2，CCL21，CD3 and CD20 in the tonsillar tissues.Results Immunohistochemistry showed that the expression of CCL21，CD3，and CD20 in CT group was much higher than that in ITH group，while the expression of CCL2 in CT group was much lower than in ITH group，with the statistical differences being significant(allP<0.05).Western blotting showed that in CT and ITH groups，the expression levels of CCL2 were(0.35±0.11)and(0.67±0.18)；those of CCL21 were(0.78±0.23)and(0.39±0.16)；those of CD3 were(2.28±0.54)and(1.27±0.39)；those of CD20 were(1.34±0.23)and(0.83±0.24)，respectively.Conclusion In the tonsillar tissues of patients with CT，CCL2 may suppress the chronic inflammation by inhibiting the lymphocyte homing.CCL21 may contribute to the occurrence of chronic inflammation by promoting the lymphocyte homing.

chronic tonsillitis； lymphocyte； chemokine

*湖北省卫生计生委科研基金资助项目(No.JXIB043)

R766.18

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.05.001

张 园，女，1987年生，博士研究生，E-mail：kaixinguo1001@126.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：zbwang@tih.tjmu.edu.cn