儿童感染MRCNS的药敏分析及SCCmec基因分型研究

熊玉玲，夏小荣，朱玉林，李长春，王亚亭



儿童感染MRCNS的药敏分析及SCCmec基因分型研究

熊玉玲，夏小荣，朱玉林，李长春，王亚亭

目的 了解安徽地区儿童感染耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)的耐药现状和葡萄球菌盒式染色体(SCCmec)基因型分布及各基因型的耐药特点。方法 对安徽地区近6年临床分离的儿童感染凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)进行表型筛选，并利用聚合酶链反应(PCR)扩增mecA的方法收集MRCNS菌株。采用标准琼脂倍比稀释法测定MRCNS 16种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)值，同时利用PCR对MRCNS进行SCCmec基因分型。结果 经表型筛选及mecA基因检测双重方法共收集MRCNS 186株，包括耐甲氧西林表皮葡萄球菌、耐甲氧西林溶血葡萄球菌、耐甲氧西林人葡萄球菌及少数其他类型MRCNS，分别为45.7%(85/186)、24.7%(46/186)、18.8%(35/186)及10.8%(20/186)。耐药分析显示MRCNS对青霉素、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、亚胺培南、美罗培南耐药率达100%，红霉素和阿奇霉素的耐药率大多在90%以上，对环丙沙星、克林霉素耐药率为80%左右，对庆大霉素、左氧氟沙星的耐药率为40%左右，对利福平的耐药率为20%左右，对氯霉素的耐药率为10%左右，对替考拉宁、万古霉素的耐药率分别为2.2%(4/186)、0.5%(1/186)。186株MRCNS的SCCmec分型共有Ⅰ～Ⅴ 5种型别，以Ⅲ型为主，Ⅳ型检出Ⅳa、Ⅳc、Ⅳd 3种亚型，并有较多的混合型存在。各基因型对多种抗菌药物呈不同程度的耐药。结论 安徽地区临床分离的儿童MRCNS对多种常用抗菌药物不敏感，具有多重耐药性，其中出现万古霉素表型耐药菌株，应予警惕。不同类型的MRCNS所携带的SCCmec型别不同，SCCmecⅢ型为主要流行菌株。SCCmec基因型与耐药谱有着密切的关系。

儿童；耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌；耐药性；聚合酶链反应；SCCmec基因型

凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase negativeStaphylococcus, CNS)属于革兰阳性球菌的重要一员，因不能产生血浆凝固酶和溶血素等物质一直被认为是皮肤黏膜的正常菌群或者机会致病菌。近年来，随着分子生物学材料领域的迅速发展，许多侵入性诊疗技术以及新的高效广谱抗菌药物、激素、免疫抑制剂在儿科临床中的广泛应用，由CNS造成的感染日趋严重，成为医院感染的重要病原菌[1-2]。国内外资料[3]显示CNS是儿科感染最常见的病原菌，尤其是新生儿、早产儿、低出生体重儿败血症的常见病原菌，其中耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(methicillin resistant coagulase negativeStaphylococcus, MRCNS)占主导地位。儿童MRCNS的检出率和多重耐药性呈逐年增高趋势，已成为儿科感染和临床治疗的重要问题。葡萄球菌盒染色体mec(Staphylococcalchromosomal cassettemec,SCCmec)是携带mecA基因的新型移动基因元件，主要由携带mecA基因的mec基因复合体、编码位点特异性重组酶的盒式染色体重组酶基因复合物以及功能未知的可变区域构成，具有自发剔除、重组的特性，是葡萄球菌耐药性产生、耐药谱扩大的根本原因[4]。该研究对安徽地区近6年儿童感染MRCNS菌株进行SCCmec基因分型研究，为了解菌株来源、流行趋势和临床合理选用抗菌药物以及制定MRCNS 感染的防治措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源及鉴定 收集安徽省细菌耐药监测中心38所医院近6年住院患儿的各种临床送检血液标本无重复分离的MRCNS共186株。全部菌株已由Microscan WalkAway-40全自动微生物分析仪(美国DADE公司)自动鉴定系统初步鉴定，经表型筛选后由聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增甲氧西林耐药基因mecA而确定为MRCNS。质控菌株ATCC43300、ATCC25923和ATCC29213由安徽省细菌耐药监控中心保存。

1.1.2 主要试剂和仪器

1.1.2.1 试剂 dNTP Mixture、Taq Buffer、DL 600 DNA Marker、DL 2 000 DNA Marker、6×Loading Buffer、琼脂糖、PCR反应引物均购自上海生工生物工程公司；溴化乙锭干粉、溶葡萄球菌素(SIGMA)购自大连宝生物公司；Mueller-Hinton(M-H)培养基、琼脂粉均购自英国Oxiod 公司。

1.1.2.2 抗菌药物 用于MIC测定的抗菌药物：苯唑西林、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢曲松、庆大霉素、氯霉素、克林霉素、红霉素、阿奇霉素、青霉素、亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、左氧氟沙星、万古霉素、替考拉宁、利福平共17种，均购自中国药品生物制品检定所，均在有效期内使用。

1.1.2.3 仪器 多点接种仪(英国 AQS Manufacturing公司)；电热恒温培养箱(上海精宏公司)；32R低温离心机(德国Hettich公司)；电子天平(上海名桥精密科学仪器公司)；凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；PCR 仪器(德国Biometra公司)；电泳仪加电泳槽(北京六一仪器厂)；超低温冰箱(日本三洋制冷设备公司)；纯水机(美国Labconco公司)；移液器(德国Eppendorf公司)；一次性玻璃试管、PCR管、EP 管、一次性细菌培养皿(上海生工生物工程技术有限公司)。

1.1.3 PCR引物 参照文献[5]报道设计PCR引物序列，并在Pubmed上进行BLAST基因序列比对，委托上海生工生物工程技术有限公司合成，见表1。

表1 SCCmec引物序列

1.2 方法

1.2.1 表型筛选MRCNS 参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)2013推荐的表型筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcusaureus, MRSA)的方法，用标准琼脂倍比稀释法进行苯唑西林最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)值的测定及结果判读，若苯唑西林MIC值≥0.5 μg/ml,则初筛该菌株为MRCNS，对初筛的MRCNS再进行mecA基因检测，两种检测方法均为阳性者确定为MRCNS菌株。

1.2.2 DNA模板的提取 将平板上的经16～18 h过夜培养的新鲜MRCNS(经表型筛选后)单个菌落，加入200 μl灭菌去离子水和适量葡萄球菌溶菌素，混匀，100 ℃煮沸10～15 min后，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，吸取上清液作为PCR扩增反应模板，-20 ℃保存备用。

1.2.3 PCR法鉴定MRCNS PCR反应在0.5 ml薄壁管中进行，总反应体积为25 μl：10 mmol/L dNTP 0.5 μl，10 pmol/L上下游引物(表1)各1 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，模板DNA 1 μl，TaqDNA聚合酶0.5 U(5 U/μl)，25 mmol/L MgCl21.5 μl，最后灭菌去离子水补齐至25 μl。扩增条件：95 ℃预变性5 min，然后进入PCR循环：95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环，72 ℃延伸5 min；每次用标准株ATCC43300作阳性对照。将5 μl PCR扩增产物和1 μl 6×Loading Buffer混匀后，加在1%琼脂糖凝胶(含0.5 μg/ml溴化乙锭和1×TAE)上，电泳电压为120 V，电流为80 mA、30 min，凝胶成像分析系统摄像，保存结果。对于147 bp处有明亮条带者判定为MRCNS，阴性菌株重复试验1次。

1.2.4 MRCNS药敏试验 采用标准琼脂倍比稀释法对MRCNS进行MIC值的测定和结果判读。以ATCC29213、ATCC25923为质控标准株，质控标准菌株对各种抗菌药物药敏结果均在CLSI2013规定的范围内。

1.2.5 MRCNS的SCCmec基因分型 对明确为MRCNS的菌株进行SCCmec基因分型，反应体系及反应条件同1.2.3，PCR扩增产物经电泳后，凝胶成像分析系统摄像，分析并保存结果。对阴性菌株重复试验1次。

1.2.6 扩增产物的测序和分析 PCR产物委托上海生工生物工程技术有限公司进行测序，所得测序结果在Pubmed中进行BLAST基因序列比对。

2 结果

2.1 MRCNS种类分布及检出率 186株MRCNS经表型筛选及PCR检测mecA均为阳性，其中包括耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcusepidermidis,MRSE)85株、耐甲氧西林溶血葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcushaemolyticus,MRSH)46株、耐甲氧西林人葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcushominis, MRSHo)35株、耐甲氧西林木糖葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcusxylosus, MRSX)6株、耐甲氧西林松鼠葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcussciuri, MRSSc)4株、耐甲氧西林模仿葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcussimulans, MRSSi)4株、耐甲氧西林华纳葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcuswarneri, MRSW)3株、耐甲氧西林腐生葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcussaprophyticus, MRSSa)1株、耐甲氧西林耳葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcusauricularis, MRAS)1株、耐甲氧西林头状葡萄球菌(methicillin resistantStaphylococcuscapitis, MRSCa)1株，MRCNS分类构成比见表2。

2.2 MRCNS耐药性分析 MRCNS对16种常见抗菌药物耐药率见表3。1株携带mecA基因的万古霉素表型耐药菌株，其对除利福平、左氧氟沙星的多种抗菌药物耐药。

2.3 MRCNS的SCCmec基因分型 186株MRCNS的mecA基因均为阳性，共检出Ⅰ～Ⅴ 5种型别，Ⅳ型检出Ⅳa、Ⅳc、Ⅳd 3种亚型，电泳结果见图1。不同类型的MRCNS所携带的SCCmec型别检出结果见表4。

表2 MRCNS分类构成比

图1 mecA与SCCmec基因扩增产物电泳结果

M：Marker；1：ATCC29213；2：ATCC43300；3～4：mecA；5～6：SCCmecⅠ；7～8：SCCmecⅡ；9～10：SCCmecⅢ；11～12：SCCmecⅣa；13～14：SCCmecⅣc；15～16：SCCmecⅣd；17～18：SCCmecV

2.4 MRCNS不同SCCmec型别的耐药率 所有型别对青霉素、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松、美罗培南、亚胺培南、阿奇霉素、红霉素、克林霉素及环丙沙星的耐药率均很高；除个别III型和混合型外，所有型别对替考拉宁和万古霉素敏感；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、混合型及未分型对利福平、左氧氟沙星、庆大霉素均有不同程度的耐药，且耐药率高于Ⅳ、Ⅴ型；Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ未发现氯霉素耐药菌株，见表5。

表3 148株儿童MRCNS对16种抗生素的耐药率[n(%)]

表4 SCCmec基因分布结果[n(%)]

表5 MRCNS不同SCCmec基因型的耐药率[n(%)]

3 讨论

近年来，我国儿童MRCNS的多数资料集中在75%左右[2，6]。儿童MRCNS的检出率和多重耐药性呈逐年增高趋势，因其毒力低、侵袭力弱、患儿感染后症状不典型等特点，给临床诊断和治疗带来一定困难。MRCNS不仅对于所有耐酶青霉素如甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林耐药，而且对包括各类广谱青霉素和头孢类(如头孢曲松、头孢噻肟、头孢美唑、头孢哌酮等)、氨基糖苷类(如链霉素、庆大霉素等)、大环内酯类、喹诺酮类、碳青霉烯类(如亚胺培南、美罗培南等)、利福平均具有不同程度的耐药[7]。MRCNS的耐药性来源，一方面是固有耐药性，这是由染色体介导的；另一方面是获得耐药性，这与质粒产生的β-内酰胺酶有关，细菌之间传递耐药基因，很多靠质粒来完成，即在葡萄球菌菌属之间通过质粒传递耐药基因，使耐药基因扩大而产生耐药；此外，生物膜的形成和主动外排系统与MRCNS的耐药性有密切关系[8-9]。本研究分离的儿童MRCNS菌株同样对多种抗菌药物耐药。如MRCNS对青霉素、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢曲松、阿奇霉素、红霉素、克林霉素、美罗培南、亚胺培南的耐药性均很高，达90%～100%，一定程度上反应了β-内酰胺类抗菌药物、三代头孢类抗菌药物、大环内酯类抗菌药物、林可霉素类抗菌药物及碳青霉烯类抗菌药物在临床的广泛应用；相对而言，对左氧氟沙星、庆大霉素、氯霉素及利福平的耐药性较低，可能与其对儿童生长发育有较多的不良反应有关；例如，左氧氟沙星易引起钙流失，长期使用会导致儿童软骨病发生；庆大霉素会影响儿童脑神经发育，导致听力下降；长期大剂量地使用氯霉素会对儿童骨髓造血系统产生抑制；利福平对儿童的肝功能有严重损害。也可能与单独使用这些抗菌药物易产生耐药等因素有关，所以这些药较少应用于儿科临床治疗。糖肽类抗菌药物如替考拉宁、万古霉素作为MRCNS治疗的最后防线，本研究显示其表型耐药菌株，考虑可能是因儿童特殊的生理特点及对多种抗菌药物的不良反应，限制很多药物的使用，而万古霉素有效的临床应用先例，使其在儿科领域广泛应用，给儿童MRCNS的治疗带来潜在的威胁。因此，为控制儿童MRCNS多重耐药率升高，对考虑败血症的患儿，临床医师宜早期进行血培养及加大抗菌药物使用前微生物标本的送检率，并依据药敏结果合理选用有效抗菌药物，以减少耐药菌株的产生和提高疗效。

SCCmec是一种携带mecA基因的新型移动基因元件。在不同的MRCNS菌株中，因外源性耐药基因的转移、嫁接，以及不同SCCmec之间耐药基因的交换，造成SCCmec染色体基因序列突变、插入或缺失，使得mec基因簇、重组酶基因簇及可变区域出现结构上的差异，这种结构上差异性是SCCmec分型的分子生物学基础。目前国外采用分子生物学技术将SCCmec基因分成Ⅰ～Ⅷ 8种类型，每一型又包含不同亚型，如Ⅳ型包括Ⅳa、Ⅳb、Ⅳc、Ⅳd 4个亚型[10-11]。SCCmec可自主从染色体上切除，以适当方式重组于受体葡萄球菌染色体上，使其获得耐药性；SCCmec使耐药基因在菌株间水平传播，从而导致耐药谱扩大和新的SCCmec型别的产生。SCCmec的基因型与MRCNS流行背景有关，不同地区和遗传背景的克隆株携带SCCmec可能不同[12-14]。本研究的186株MRCNS可扩增Ⅰ～Ⅴ 5种SCCmec基因型，Ⅳ型可扩增出Ⅳa、Ⅳc、Ⅳd。安徽地区儿童MRCNS的SCCmec基因分型以Ⅲ型为主要流行株，占50.5%(94/186)，同国内其他地区报道[15-16]结果一致；其次为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ彼此之间或与其他各型混合，占19.4%(36/186)；剩余的Ⅰ、Ⅱ、Ⅳa、Ⅳc、Ⅳd及Ⅴ各型所占比例较少，分别为4.3%(8/186)、3.8%(7/186)、3.8%(7/186)、0.5%(1/186)、1.1%(2/186)及2.2%(4/186)。但有14.5%(27/186)未能分型，可能由于SCCmec移动模块的变异率非常高，自身不断地发生突变、插入或缺失，造成了扩增引物区序列的变化，从而PCR检测的方法失败；也可能有其他耐药机制或者新的耐药基因的出现，尚不在本研究范围。

SCCmec基因型与耐药谱有着密切的关系，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型由于基因序列较长，内含耐药基因的质粒或转座子，呈多重耐药性，常常表现对β-内酰胺类、碳青霉烯类、氨基糖苷类、大环内酯类及氟喹诺酮类等抗菌药物耐药；而Ⅳ、Ⅴ型除含mecA基因外，很少含有其他的耐药基因，对非β-内酰胺类抗菌药物耐药率大多低于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，这种耐药程度上的差异可以为临床治疗MRCNS提供依据。

综上所述，安徽地区近6年临床分离的儿童MRCNS具有多重耐药的特征，并存在万古霉素表型耐药菌株，儿科医师应提高感染患儿抗菌药物使用前微生物标本的送检率，尽可能根据药敏结果，合理选用有效抗菌药物。SCCmecⅢ型为主要流行株。因此，SCCmec基因型别的确定，对制定儿童MRCNS感染预防和控制措施有重要意义。

[1] 汪 复,朱德妹,胡付品,等.2012年中国CHINET细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志, 2013, 13(5):321-30.

[2] 杨亚静,张 砺,王 莉,等.2011年度卫生部全国细菌耐药监测报告:0至14岁儿童细菌耐药监测[J].中国临床药理学杂志,2014,30(2):83-8.

[3] Pourakbari B,Sadr A,Ashtiani M T,et al.Five-year evaluation of the antimicrobial susceptibility patterns of bacteria causing bloodstream infections in Iran[J].J Infect Dev Ctries,2012,6(2):120-5.

[4] IWG-SCC. Classification ofstaphylococcalcassette chromosomemec(SCCmec) guidelines for reposing novelSCCmecelements[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(12):4961-7.

[5] Zhang K, Mcclure J A, Elsayed S, et al. Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcalcassette chromosomemectypes Ⅰ to Ⅴ in methieillin-resistantStaphylococcusaureus[J]. J Clin Microbiol, 2005,43(10):5026-33.

[6] 旷凌寒,江咏梅,胡正强,等.儿科血液病房血培养病原菌分布及耐药情况分析[J].中国当代儿科杂志,2013,15(4):259-63.

[7] Fritsche T R, Rennie R P, Goldstein B P, et al. Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms[J].J Clin Microbiol,2006, 44(8):2988-90.

[8] 杨名保,邱书奇,柯朝阳.细菌生物膜及其相关感染的研究进展[J].中华临床医师杂志,2011,5(9)：2575-6.

[9] 金 浩,顾 兵,居会祥,等.凝固酶阴性葡萄球菌主动外排基因MsrA的检测分析[J].南京医科大学学报,2012,32(5):7135.

[10]Oliveira D C, Milheirieo C, de Lencastre H. Redefining a structural variant ofstaphylococcalcassette chromosomemec,SCCmectype VI[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2006,50(10):3457-9.

[11]Zhang K, McClure J A, Elsayed S, et al. Novelstaphylococcalcassette chromosomemectype, tentatively designated type Ⅷ, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methieillin resistantStaphylococcusaureus[J]. Antimicrob Agents Chemother,2009, 53(2):531-40.

[12]Valsesia G, Rossi M, Bertschy S, et al. Emergence ofSCCmecType Ⅳ andSCCmecType Ⅴ methieillin-resistantStaphylococcusaureuscontaining the Panton-Valentine leukecidin genes in a large academic teaching hospital in central Switsedand: external invaders or persisting circulators?[J]. J Clin Microbiol,2010, 48(3):720-7.

[13]Argudin M A, Fetsch A, Tenhagen B A, et al.High heterogeneity within methicillin resistantStaphylococcusaueusST398 isolares, deftned by macrorestriction-pulsed-field gel electrophoresis profiles and spa andSCCmectypes[J]. Appl Environ Microbiol,2010,76(3):652 -8.

[14]Conceicão T,Tavares A, Miragaia M,et al. Prevalence and clonality of methieillin resistantStaphylococcusaureus(MRSA) in the Atlantic Azores islands:predominance ofSCCmectypes Ⅳ, Ⅴ and Ⅳ[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2010,29 (5):543-50.

[15]陈日炳,万彦彬,胡 琴,等.深圳东部地区耐甲氧西林葡萄球菌SCCmec基因型分析[J].国际检验医学杂志,2012,33(3):265-7.

[16]王爱玲,纪 冰,宿振国,等.MRSA的SCCmec分型研究及耐药性分析[J].中国病原生物学杂志,2012,7(12):897-900.

On antibiotic resistance andSCCmecmolecular epidemiology

of methicillin resistant coagulase negativeStaphylococciin Children

Xiong Yuling, Xia Xiaorong, Zhu Yulin,et al

(DeptofPaediatrics,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

Objective To learn the drug resistance of methicillin resistant coagulase negativeStaphylococcus(MRCNS) and to investigate the distribution and antimicrobial resisitance of different MRCNSSCCmecgenotyping from children in Anhui. Methods Resistance phenotype screening and Polymerase Chain Reaction(PCR)mecAgene detection were conducted in clinical strains of coagulase negativeStaphylococcus, in order to collect MRCNS in recent six years from children in Anhui. Minimal inhibitory concentrations of 16 antibiotics were determined by agar dilution method, thenSCCmectypes were determined by PCR methods. Results A total of 186 MRCNS were detected by resistance phenotype screening and PCRmecAgene detection methods.There were 45.7%(85/186) methicillin resistantStaphylococcusepidermidis, 24.7%(46/186) methicillin resistantStaphylococcushaemolyticus, 18.8%(35/186) methicillin resistantStaphylococcushominis, 10.7%(20/186) other types of MRCNS. Drug resistance analysis showed the resisitance rates to penicillin, cefoperazone, cefotaxime, ceftriaxone, imipenem, and meropenem were 100%, to erythromycin and azithromycin were about 90%, to ciprofloxacin and clindamycin were about 80%, to gentamicin and levofloxacin were about 40%, to rifampincin was about 20%, to chloramphenicol, teicoplanin and vancomycin were 10%, 2.2% and 0.5%. Ⅰ to ⅤSCCmecgenotypes were detected in 186 MRCNS, the major type wasSCCmectype Ⅲ. Three subtypes of Ⅳ genotype were identified, including Ⅳa, Ⅳc and Ⅳd, the second type was hybrid type. Each genotype showed varying degrees of resistance to several antibiotics. Conclusion Clinical strains of children infected MRCNS isolated from Anhui have multiple resistances to commonly used antibiotics. It should be on alert that vancomycin phenotypic drug resistant strain appears. Different types of MRCNS carry different types ofSCCmec,SCCmecⅢ genotype is the major epidemic isolates.SCCmecgenotype and drug resistance spectrum have a close relationship.

children; methicillin resistant coagulase negativeStaphylococci; drug resistance; polymerase chain reaction;Staphylococcalcassette chromosomemec

时间：2016-8-10 11:04:48

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.008.html

2016-05-30接收

安徽省自然科学基金(编号：1408085QH157)

安徽医科大学第一附属医院儿科，合肥 230022

熊玉玲，女，硕士研究生；

王亚亭，男，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E-mail:wangyating1348@126.com

R 446.5

A

1000-1492(2016)10-1430-06

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.008